Xác định chỉ tiêu E. coli áp dụng theo TCVN 6846:2007, ISO 7251:2005. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện và đinh lượn E. coli giảđịnh – Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất.
- Nguyên tắc: Kỹ thuật này tiến hành theo phương pháp MPN và sử dụng bảng chỉ số MPN để tính kết quả. Tổng số E. coli có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm thực phẩm được xác định bằng số ống dương tính sau khi nuôi cấy vào các ống canh thang EC ở 45,50C/48 giờ, cho thử nghiệm IMVCi.
- Môi trường và hóa chất
+ Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn E. coli là môi trường canh thang tryptoza lauryl sunfat.
+ Canh thang Brilliant Green 2% Broth.
- Cách tiến hành:
+ Bước 1: Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử
Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc say nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi đồng nhất. Cân chính xác 25g mẫu cho vào ống nghiêm chứa 225ml dung dịch nước muối sinh lý. Lắc đều trong 2-3 phút. Thu được dung dịch pha loãng 10-1.
Hút chính xác 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9ml dung dịch nước muối sinh lý, lắc đều. Thu được dung dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục với những nồng độ tiếp theo thu được dung dịch pha loãng 10-3,10-4...
+ Bước 2: Nuôi cấy mẫu
Đối với 1 mẫu phải nuôi cấy ở 3 đậm độ (10-1, 10-2, 10-3), mỗi đậm độ nuôi cấy trong 3 ống canh thang Lauryl tryptose, mỗi ống 1ml dung dịch mẫu thử.
Ủấm 370C/24-48 giờ.
Xác định sốống dương tính ở từng đậm độ (làm đục canh thang và sinh hơi). + Bước 3: Cấy chuyển
Từ các ống dương tính trên, dùng que cấy vô trùng cấy chuyển tương ứng canh trùng sang những ống canh thang Brilliant Green Bile 2% Broth, mỗi ống 1ml.
Sau đó, ủấm ở 440C/48 giờ.
Xác định sốống dương tính ở từng đậm độ (làm đục canh thang, sinh hơi...) + Bước 4: Phân lập E. coli
Từ những ống Coliforms dương tính ở trên, dùng que cấy vô trùng ria lên thạch Macconkey, để tủấm 370C/24h.
Những đĩa thạch dương tính (+) cho khuẩn lạc màu hồng cánh sen, chọn 3 khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường nước thịt (Nutrient broth), nuôi 440C/24h.
Từ các ống môi trường nước thịt, nhỏ vào 1 – 2 giọt kovac, quan sát sự hình thành vòng nhẫn đỏ, nếu xuất hiện vòng nhẫn đỏ ghi là (+), không sinh vòng nhẫn
đỏ ghi là (-). Ghi lại những ống có phản ứng sinh Indol (+). + Bước 5: Tính kết quả
Đếm sốống dương tính của môi trường tăng sinh chọn lọc.
Từ những ống dương tính, tra bảng MPN để xác định tổng số E. coli giảđịnh có trong 1g mẫu.
1. Đồng nhất và pha loãng 1 ml 10-1 25g mẫu 225 ml NMSL 10-2 10-3 9 mL NMSL
CT Lauryl sulfat nồng độđơn 370C /24h±2h hoặc đến 48h±2h 3.Cấy chuyển 2. Nuôi cấy mẫu 1 ml 1 ml
4. Phân lập trên thạch MacConkey 35oC – 37oC/24h 5. Thử nghiệm IMViC
CT Brilliant Green Bile 2% Broth 440C/48h CT Lauryl sulfat nồng độ kép
370C hoặc 30oC/24h±2h
1 ml 1 ml
SƠ ĐỒ KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG E. COLI
TRONG THỰC PHẨM – KỸ THUẬT MPN
Hình 3.3: Sơđồ phương pháp xác định E. coli trong thực phẩm theo phương pháp MPN
Đánh giá, chỉ tiêu theo dõi
- Chỉ tiêu đánh giá Coliforms và E. coli:
+ Các canh khuẩn có khả năng sinh hơi và sinh khí phát triển trên môi trường chọn lọc + Công thức tính N= Số mẫu dương tính x100 Tổng số mẫu thử N: Số phần trăm của vi khuẩn có kết quả dương tính
