đoạn dịch chiết từ vỏ thân bứa
2.2.3.1. Thử độc tính theo đ-ờng uống, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết từ vỏ thân bứa theo đ-ờng uống là xác định liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm. Chuột đ-ợc nhịn đói tr-ớc 16h thí nghiệm và đ-ợc cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng (liều tối đa
cho phép), theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết từ vỏ thân bứa.
2.2.3.2. Nghiên cứu tác dụng chống béo phì của các phân đoạn dịch chiết 2.2.3.2.1. Mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss (khối l-ợng ban đầu là 13 – 15g) đ-ợc chia làm nhiều lô, mỗi lô gồm khoảng từ 6 – 9 con.
Lô nuôi th-ờng: Cho ăn chế độ bình th-ờng (thức ăn của Viện vệ sinh Dịch tễ TW).
Các lô còn lại: Cho ăn thức ăn giàu lipid với thành phần đ-ợc trộn từ nhiều loại thức ăn khác nhau nh-: ngô, sữa bột, đậu t-ơng, lòng đỏ trứng, lạc, mỡ nước…
Thời gian nuôi chuột theo 2 chế độ ăn là 6 tuần.
Bảng 1. Thành phần thức ăn giàu lipid
Thành phần Tỉ lệ % Hydratcacbon 41 Lipid 32 Protein 20 Cholesterol 1 Chất khoáng 4 Vitamin & axit amin 2
Thành phần thức ăn đ-ợc tính toán dựa trên thành phần d-ỡng chất của từng loại hỗn hợp thức ăn phối trộn, theo tài liệu chuẩn của Viện dinh d-ỡng quốc gia Việt nam .
Sau 6 tuần nuôi, tiến hành cân đo trọng l-ợng và xét nghiệm một số chỉ số hoá sinh nh-: glucose máu, lipid máu gồm cholesterol toàn phần, triglycerid,
HDLc, LDLc để xác định mức độ khác nhau của các lô theo hai chế độ ăn.
2.2.3.2.2. ảnh h-ởng của các phân đoạn dịch chiết đến một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột sau khi nuôi bằng mô hình gây béo phì thực nghiệm, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm. Chuột béo phì đ-ợc chia làm 9 lô, mỗi lô gồm khoảng 6 – 9 con. cao của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ thân bứa đ-ợc hòa vào n-ớc cất rồi cho chuột uống hàng ngày vào buổi sáng:
+ Lô 1: Chuột ăn thức ăn chuẩn ( mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW) . Lô
đối chứng(+) + Lô 2: Chuột ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol, không điều trị. Lô
đối chứng (+)
+ Lô 3: Chuột ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol, uống dịch chiết cao cồn tổng số (80%) từ vỏ thân cây bứa.
+ Lô 4: Chuột ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol, uống dịch chiết phân đoạn n – hexan từ vỏ thân cây bứa.
+ Lô 5: Chuột ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol, uống dịch chiết phân đoạn ethylaxetat từ vỏ thân cây bứa.
+ Lô 6: Chuột gây ĐTĐ type 2, ( béo phì nuôi 6 tuần sau đó tiêm STZ (100- 110% mg/bw) không điều trị. Lô đối chứng (+)
+ Lô 7: Chuột gây ĐTĐ type 2, uống dịch chiết phân đoạn cao ethanol
+ Lô 8: Chuột gây đái tháo đ-ờng type 2, điều trị bằng Metformin
(Merk) một loại thuốc chữa béo phì, tiểu đ-ờng type 2 hiện đang bán trên thị tr-ờng với liều 500mg/kg thể trọng.( Điều trị 3 tuần).
+ Lô 9 : Chuột gây ĐTĐ type 2, uống dịch chiết phân đoạn n- hexan từ vỏ thân cây bứa , điều trị 3 tuần.
2.2.3.3. Ph-ơng pháp định l-ợng một số chỉ số hoá sinh (glucose, lipid máu) 2.2.3.3.1. Ph-ơng pháp định l-ợng glucose huyết.
Máu sử dụng để định l-ợng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi
chuột. Định l-ợng glucose huyết bằng máy đo đ-ờng huyết tự động và bộ kít thử t-ơng ứng (One Touch Ultra, Johnson & Johnson, USA). Nguyên tắc của ph-ơng pháp dựa trên phản ứng đặc hiệu của glucoseoxidase (GOD) có trong kít thử với glucose trong máu tạo thành axit gluconic và H2O2 (phản ứng 1). H2O2 tạo thành đ-ợc peroxydase phân hủy giải phóng oxy, oxy hoá
O-Dianisidin tạo phức chất mầu vàng nâu (phản ứng 2). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Glucose + H2O2 + O2 axit gluconic + H2O2 (1) O-Dianisidin + H2O2 phức hợp nâu vàng + H2O2 (2)
C-ờng độ mầu đ-ợc xác định theo ph-ơng pháp đồ t-ơng ứng với l-ợng
glucose trong máu cần định l-ợng.
2.2.3.3.2. Định l-ợng triglycerid huyết thanh
Nguyên lý: Thuỷ phân triglycerid bằng enzyme lipase, định l-ợng glycerol
giải phóng ra bằng ph-ơng pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4-
aminoantipyryl và 4-chlorophenol phản ứng với peroxidehydrogen theo các phản ứng sau:
Triglycerid lipoproteinlipase
Glycerol + acid béo Glycerol + ATP glycerolkinase
Glycerol–3–phosphate +O2 g lycero l3p h o sp h a teo xid a se
Dihydroxyacetone phosphate + H2O2
H2O2 + aminoantipyrine + 4–chlorophenol peroxidase
quinonimin + 4HCl + 4H2O
Tính kết quả: Đo mật độ quang học quinonimin ở b-ớc sóng 546 nm rồi so với chuẩn.
2.2.3.3.3. Định l-ợng cholesterol toàn phần trong huyết thanh
Nguyên lý: Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterolesterase
(CHE) và oxy hoá bằng cholesteroloxydase (CHO). Đo mật độ quang của
quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogenperoxide với 4-aminophenazone
và phenol nhờ xúc tác của peroxidase. Các phản ứng:
Cholesterol este + H2O CHE
Cholesterol + acid béo Cholesterol + O2 CHO
Cholesterol–3– one + H2O2 2H2O2 + 4 – aminophenazone + phenol Peroxidase
Quinonimin + H2O
Tính kết quả : So mật độ quang của quinonimin với ống chuẩn