2.2.2.1.1. Định tính flavonoid
Mẫu thử đ-ợc pha trong Ethanol với một l-ợng thích hợp, thêm vài giọt HCl đặc.
- Phản ứng Shinoda: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài mảnh Mg và đun trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng d-ơng tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
- Phản ứng với acid sunfuric: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
- Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCl đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng d-ơng tính .
2.2.2.1.2. Định tính tannin
Mẫu thử cũng đ-ợc pha nh- trên và làm các phản ứng:
- Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng d-ơng tính khi thu đ-ợc màu đỏ đậm.
- Phản ứng với gelatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng d-ơng tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
- Phản ứng với acetate chì: cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào dung dịch mẫu, phản ứng d-ơng tính khi xuất hiện kết tủa.
- Phản ứng với dung dịch kiềm: Dung dịch mẫu thử đ-ợc pha nh- trên. Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng d-ơng tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
- Phản ứng với FeCl3: Nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0,5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử đ-ợc pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả d-ơng tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.
2.2.2.1.4. Định tính glycoside Phản ứng Keller-Killian: Thuốc thử Keller-Killian:
Dung dịch A: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid acetic 10%. Dung dịch B: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid sunfuric đặc. Ph-ơng pháp: Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng d-ơng tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
2.2.2.1.5. Định tính alkaloid
Mẫu thử đ-ợc pha trong dung dịch acid acetic 2% với một l-ợng thích hợp để làm các phản ứng.
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): phản ứng cho kết tủa màu nâu sẫm.
Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong n-ớc):
phản ứng cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (hỗn hợp Bi(NO3)3 )và KI trong dung dịch acid acetic): phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ.
2.2.2.2. Định l-ợng hợp chất polyphenol tổng số theo ph-ơng pháp Folin –
Ciocalteau
Xây dựng đ-ờng chuẩn acid gallic
Hóa chất:
+ Dung dịch gốc acid gallic nồng độ 5000 mg/l gồm: 0,5 g acid gallic + 10 ml ethanol + 90 ml H2O.
+ Dung dịch Na2CO3 20%, dung dịch thuốc thử Folin - Ciocalteau.
Tiến hành:
+ Pha loãng dung dịch acid gallic theo cốc nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, 500 mg/l.
+ Chuẩn bị 6 cốc định l-ợng đánh số từ 1 đến 6, lần l-ợt mỗi cốc cho 20 ml dung dịch acid gallic với các nồng độ nêu trên + 1,58 ml H2O + 100 ml thuốc thử Folin – Ciocalteau. Sau 5 phút cho thêm 300 ml dung dịch Na2CO3. Để hỗn hợp phản ứng trong 2 giờ ở 200C rồi đo OD b-ớc súng 765 nm .
+ Dựng đường chuẩn acid gallic.
mg/l acid gallic OD765nm 1 0 0,009 2 50 0,060 3 100 0,115 4 150 0,168 5 250 0,263 6 500 0,519 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả xây dựng đ-ờng chuẩn acid gallic - Định l-ợng polyphenol tổng số
Cân 10 mg mẫu thử thuộc mỗi phân đoạn dịch chiết hoà tan trong 1 ml
ethanol 80%, bổ sung thêm n-ớc cất vào cho đủ 10 ml dung dịch để thu đ-ợc dung dịch gốc có nồng độ chất tan là 10.000 mg/l. Lấy 1 ml dung dịch gốc hòa với 9 ml n-ớc cất thu đ-ợc dung dịch cao có nồng độ 1000 mg/l.
Tiến hành thử nghiệm t-ơng tự nh- đối với dung dịch acid gallic, xác định giá trị OD, từ đó tính nồng độ polyphenol trong dung dịch và thành phần phần trăm về khồi l-ợng polyphenol trong mỗi phân đoạn dịch chiết.
Theo đó:
Hàm l-ợng polyphenol trong dung dịch = 1000.( OD – 0,0128) (mg/l)
2.2.2.3. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký lớp mỏng
Chúng tôi tiến hành sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254. Hệ dung môi chạy sắc ký là TEAF: 5:3:1:1 (toluen –
ethylaxetat - acetone - acid formic). Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10%. Xác định hệ số Rf theo công thức: Rf = a/b
- a: Khoảng di chuyển của chất nghiên cứu - b: Khoảng di chuyển của dung môi