Ul Hasan M. và cs (2006) [41] đã tiến hành một nghiên cứu nhanh để xác định tỷ lệ nhiễm Trypanosoma evansi ở những loại mẫn cảm tại Punjab (Pakistan). 170 ngựa và 150 lạc đà đã được kiểm tra bằng phương pháp huyết thanh học phát hiện có 6 lạc đà (chiếm 4,0%) và phương pháp xác định ký sinh trùng phát hiện có 5 lạc đà (chiếm 3,3%) nhiễm T. evansi; không phát hiện ngựa nhiễm bệnh.
Umezawa E. S. và cs (2009) [42] sử dụng các phương pháp TESA - blot, TESA - ELISA, epimastigotes - ELISA chẩn đoán chó bị nhiễm Trypanosoma
cruzi để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu. Kết quả cho thấy, phương pháp TESA -
blot có độ nhạy và độ đặc hiệu 100%; TESA - ELISA có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 94,1%; epi - ELISA có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 49,4%.
Tamarit A. Và cs (2010) [39] cho biết: một đợt bùng phát bệnh do
Trypanosoma evansi xảy ra ở Trung Tây Ban Nha được phát hiện. Các ổ dịch
xảy ra ở trang trại ngựa, lừa và lạc đà. Bằng phương pháp soi tươi đã xác định được 76% lạc đà, 35% lừa và 2% ngựa nhiễm T. evansi. Các loài động vật đã được cách ly và điều trị bằng Cymelarsan với liều 0,5 mg/kg. Sau thời gian điều trị, kiểm tra lại máu của số động vật này đều cho kết quả âm tính với T. evansi.
Haridy F. M. và cs (2011) [32] đã lựa chọn ngẫu nhiên 300 con lạc đà (200 lạc đà đực 4 - 6 tuổi và 100 lạc đà cái 10 - 15 năm tuổi) để xác định tỷ lệ nhiễm bệnh do Trypanosoma evansi. Các phương pháp chẩn đoán gồm chẩn đoán lâm sàng, nhuộm giemsa tiêu bản máu và ELISA. Phương pháp nhuộm giemsa phát hiện 6,0% lạc đà đực và 9,0% lạc đà cái nhiễm T. evansi. Phương pháp ELISA phát hiện 8,0% lạc đà đực và 24,0% lạc đà cái nhiễm T. evansi. Kết quả cho thấy phương pháp chẩn đoán ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn phương pháp nhuộm giemsa.
Rodriguez N. F. và cs (2012) [38] đã kiểm tra 1.228 mẫu huyết thanh gia súc tại châu Phi, kết quả có 61 mẫu huyết thanh dương tính với T.
evansi, chiếm tỷ lệ 4,97%.
Kumar R. và cs (2013) [34] cho biết: kiểm tra trong 2 năm (9/2009 – 8/2011), có 420/3695 mẫu huyết thanh ngựa tại 6 khu vực thuộc Ấn Độ dương tính với T. evansi.
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Trâu của một số xã thuộc huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang.
- Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp.
- Bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi gây ra.
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
- Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp.
- Mẫu máu trâu thu thập tại một số xã thuộc huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang
- Chuột bạch dùng để tiêm truyền phải khỏe mạnh, khối lượng 18 – 20 g/con.
* Thuốc để nghiên cứu phác đồđiều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu
+ Thuốc diệt tiên mao trùng: phar – trypazen, trypamidium samorin, trypanosoma.
+ Thuốc trợ tim: cafein natri benzoat 20%.
+ Thuốc nâng cao thể trạng và sức đề kháng: nước sinh lý mặn, vitamin C 5%, vitamin B1 2,5%. * Hoá chất nghiên cứu: - Dầu bạch dương. * Dụng cụ dùng trong nghiên cứu: - Kính hiển vi quang học. - Lam kính.
- Lamen.
- Ống eppendorf
- Xilanh 1 ml, 3 ml, 5 ml và kim tiêm các loại. - Chuồng nuôi động vật thí nghiệm.
- Một số dụng cụ thí nghiệm khác.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm thu thập mẫu: các nông hộ, các trại chăn nuôi gia đình tại một số xã thuộc huyện Sơn Dương – tỉnh Tuyên Quang.
- Địa điểm xét nghiệm mẫu: Phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh động vật – Khoa Chăn nuôi thú y – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ ngày 09/6/2014 đến ngày 24/11/2014
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Ứng dụng Kit CATT chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp nghiên cứu tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang.
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi. - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt.
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo các tháng trong năm.
3.3.2. Nghiên cứu thử nghiệm phác đồđiều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu và
đề xuất biện pháp phòng chống
3.3.2.1. Xây dựng phác đồđiều trị bệnh tiên mao trùng
- Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp. - Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện rộng.
3.3.2.2. Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng cho trâu ở
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp thu thập mẫu
* Lấy mẫu máu trâu: Sát trùng vùng tĩnh mạch cổ trâu bằng cồn 700
. Dùng xilanh nhựa 3 ml lấy máu tĩnh mạch cổ trâu. Tiêm ngay 0,2 ml máu vào phúc mạc chuột bạch. Ghi ký hiệu mẫu; thể trạng trâu; triệu chứng lâm sàng (nếu có); tên chủ hộ; địa chỉ; ngày lấy mẫu. Bảo quản ở 40
C.
* Chắt huyết thanh: để nghiêng xilanh 450 sao cho diện tích bề mặt máu rộng tối đa. Cố định xilanh cho đến khi máu đông, chắt lấy huyết thanh. Bảo quản huyết thanh ở nhiệt độ -150C, thời gian bảo quản không quá 4 tháng.
* Phương pháp lấy máu chuột: dùng kim chích vào chóp đuôi chuột, vuốt nhẹ đuôi để máu chảy, nhỏ 1 giọt lên phiến kính, đậy lamen để soi tươi hoặc phết kính nhuộm giemsa.
3.4.2. Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trong mẫu
3.4.2.1. Phương pháp Kit CATT
* Thành phần của Kit:
- Tube màu vàng: chứa 1,5 ml kháng nguyên RoTAT 1.2 phủ hạt latex - Tube màu xanh: chứa 1 ml huyết thanh âm tính chuẩn
- Tube màu đỏ: chứa 1 ml huyết thanh dương tính chuẩn đặc hiệu với
Trypanosoma evansi
- Ống falcon chứa 20 ml dung dịch pha loãng huyết thanh: 1 ống - Card phản ứng: 3 card
- Que khuấy: 5 cái
* Các bước làm phản ứng CATT:
- Bước 1: Chuyển Kit về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
- Bước 2: Dùng micropipet lấy 0,5 ml dung dịch pha loãng huyết thanh vào ống eppendorf.
- Bước 3: Lấy 0,1 ml huyết thanh cần chẩn đoán trộn đều vào ống eppendorf có chứa dung dịch pha loãng huyết thanh.
- Bước 4: Nhỏ lên các ô tròn trên card phản ứng, mỗi ô (10 µl) kháng nguyên RoTAT 1.2 phủ hạt latex.
- Bước 5: Nhỏ các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán (đã chuẩn bị ở bước 3), huyết thanh dương tính chuẩn, huyết thanh âm tính chuẩn vào các ô đã gắn kháng nguyên, mỗi ô 10 µl.
- Bước 6: Dùng que khuấy, trộn đều kháng nguyên và kháng thể. Sau 3 đến 5 phút đọc kết quả dựa trên sự hình thành đám ngưng kết.
+ Có hiện tượng ngưng kết: Dương tính (+) + Không có hiện tượng ngưng kết: Âm tính (-)
+ Có hiện tượng ngưng kết nhưng không rõ: Nghi ngờ (±)
3.4.2.2. Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm
Tiêm trực tiếp máu trâu vừa lấy cho chuột bạch (không sử dụng chất chống đông). Mỗi chuột tiêm 0,2 ml máu, vào phúc mạc. Theo dõi biểu hiện của chuột thí nghiệm sau tiêm truyền. Mỗi ngày kiểm tra máu chuột thí nghiệm 1 lần để phát hiện tiên mao trùng bằng phương pháp xem tươi.
3.4.2.3. Phương pháp xem tươi (Direct smear)
Cho 1 giọt máu tươi lên phiến kính; đậy lamen lên để dàn máu thành một lớp mỏng; soi dưới kính hiển vi (10 x 20 hoặc 10 x 40) để phát hiện tiên mao trùng qua sự di chuyển của chúng (dẫn theo Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2008 [8]).
Kết quả: Dương tính khi thấy tiên mao trùng di động trong huyết tương.
Âm tính khi chỉ nhìn thấy hồng cầu trên tiêu bản.
3.4.3. Một số quy định trong nghiên cứu đặc điểm dịch tễ
* Quy định về tuổi trâu
- Tuổi trâu nghiên cứu được phân ra theo 4 lứa tuổi: ≤ 2 năm tuổi
> 2 – 5 năm tuổi
> 5 – 8 năm tuổi > 8 năm tuổi
* Các tháng theo dõi trong năm
3.4.4. Xây dựng phác đồđiều trị bệnh tiên mao trùng
Xây dựng 3 phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng, mỗi phác đồ gồm: thuốc diệt tiên mao trùng, thuốc trợ tim, thuốc nâng cao thể trạng và sức đề kháng.
- Thuốc diệt tiên mao trùng:
+ Phác đồ I: trypanosoma liều 1 mg/kgTT/lần (Lọ 1,25 g pha trong 6 ml sinh lý nước mặn), lọ thuốc bột pha tiêm chứa 125 mg chlorhydrat chlorur isometamidium. Nhà sản xuất: Công ty thuốc thú y Hanvet.
+ Phác đồ II: trypamidium samorin liều 1 mg/kgTT/lần (Lọ 1,25 g pha 6,25 ml sinh lý nước mặn), gói thuốc bột pha tiêm 125 mg chứa 125 mg isometamidium chloride hypochloride. Nhà sản xuất: MERIAL Pháp.
+ Phác đồ III: phar – trypazen liều 1,18 g/150kgTT/lần (Lọ 1,18 g pha trong 7 ml sinh lý nước mặn), lọ thuốc bột pha tiêm 1,18 g chứa 525 mg diminazen diaceturat. Nhà sản xuất: Công ty thuốc thú y Pharmavet.
- Thuốc trợ tim: cafein natri benzoat 20% liều 15 ml/con/lần. Nhà sản xuất: Công ty thuốc thú y Hanvet.
- Thuốc trợ sức, trợ lực: nước sinh lý mặn 200 ml/con, vitamin C 5% (15 ml/con/lần), vitamin B1 2,5% (15 ml/con/lần).
Đường đưa thuốc:
- Tiêm sâu bắp thịt: không được tiêm quá 15 ml một vị trí tiêm.
- Truyền tĩnh mạch: truyền thật chậm.
Để xác định hiệu lực của phác đồ điều trị, chúng tôi đã bố trí các thử nghiệm trên diện hẹp và trên thực địa. Sau đó lựa chọn một phác đồ tốt nhất để điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu ở địa phương.
3.4.5. Đề xuất và ứng dụng biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả
Dựa trên kết quả nghiên cứu về tình hình dịch tễ và kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu tại huyện Sơn Dương tỉnh Tuyên Quang, chúng tôi đề xuất và khuyến cáo người chăn nuôi ứng dụng,
đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của huyện.
3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học (Theo tài liệu của Nguyễn Văn Thiện, 2008) [27], trên phần mềm Excel 2007.
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Xác định tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang Dương, tỉnh Tuyên Quang
4.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở một số xã thuộc huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang Tuyên Quang
Để nghiên cứu tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại huyện Sơn Dương, chúng tôi tiến hành lấy ngẫu nhiên mẫu máu của trâu tại 3 xã là Hợp Thành, Bình Yên và Kháng Nhật để kiểm tra. Tổng số mẫu máu kiểm tra là 205 mẫu. Kết quả kiểm tra mẫu máu được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại một số xã thuộc huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang
Địa phương (xã) Số trâu kiểm tra (con) Phương pháp Kit CATT Phương pháp tiêm truyền chuột Số trâu nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Số trâu nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Hợp Thành 61 6 9,84 6 9,84 Bình Yên 75 8 10,67 8 10,67 Kháng Nhật 69 7 10,14 7 10,14 Tính chung 205 21 10,24 21 10,24
Hình 4.1: Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu xác định bằng phương pháp Kit CATT và tiêm truyền chuột (%)
Kết quả bảng 4.1 hình 4.1 cho thấy:
Phương pháp tiêm truyền chuột là phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chính xác nhất. Qua kết quả trên, chúng tôi thấy Kit CATT cũng phát hiện bệnh chính xác tương đương phương pháp tiêm chuyền chuột.
Như vậy, xác định trâu nhiễm tiên mao trùng bằng phương pháp Kit CATT nhanh, tốn ít thời gian, dễ thực hiện.
Trong tổng số 205 trâu kiểm tra ở 3 xã thuộc huyện Sơn Dương có 21 con trâu mắc bệnh, chiếm 10,24%. Xã Bình Yên kiểm tra 75 trâu phát hiện 8/75 (10,67%) trâu nhiễm tiên mao trùng tỷ lệ nhiễm cao nhất trong 3 xã. Xã Bình Yên kiểm tra 69 trâu phát hiện 7/69 (10,14%) trâu nhiễm tiên mao trùng. Xã Hợp Thành kiểm tra 61 con, phát hiện 6/61 (9,84%) trâu nhiễm tiên mao trùng thấp nhất trong 3 xã.
Như vậy, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại địa phương có sự khác nhau. Xã Hợp Thành gần đường quốc lộ, người dân chủ yếu làm nghề buôn bán, trâu ít phải lao động nặng nhọc. Mặt khác, số lượng cây cối , thảm thực vật thưa nên ruồi, mòng không có điều kiện sinh sản, đốt, hút máu trâu truyền bệnh. Vì vậy, tỷ lệ trâu mắc bệnh ở đây thấp nhất. Xã Bình Yên và Kháng Nhật do xa đường quốc lộ, kinh tế chưa phát triển nhiều, phương thức chăn nuôi chủ yếu là chăn thả hoàn toàn nên trâu chăm sóc, nuôi dưỡng không tốt.
Vào vụ mùa, trâu phải làm viêc nặng nhọc ngoài đồng, thời gian tiếp xúc với ruồi mòng nhiều. Vì vậy, tỷ lệ trâu nhiễm tiên mao trùng xã này cao hơn so với xã Hợp Thành.
4.1.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi
Tuổi của vật nuôi là một trong những yếu tố có thể ảnh hưởng đến tính cảm thụ đối với bệnh ký sinh trùng. Vì vậy, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi trâu là một chỉ tiêu xác định trâu ở lứa tuổi nào dễ cảm nhiễm tiên mao trùng nhất để có kế hoạch phòng trị thích hợp. Kết quả tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi trâu được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi Lứa tuổi
(năm)
Số trâu kiểm tra (con) Số trâu nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) ≤ 2 43 3 6,98 >2 – 5 56 5 8,93 >5 – 8 52 6 11,54 > 8 54 7 12,96 Tính chung 205 21 10,24
Qua bảng 4.2 cho thấy:
Trâu ở mọi lứa tuổi đều bị nhiễm tiên mao trùng, nhưng tỷ lệ nhiễm thay đổi theo lứa tuổi. Kiểm tra mẫu máu của trâu dưới 2 tuổi có 3/43 (6,98%) trâu bị nhiễm tiên mao trùng. Trâu từ 2 đến 5 tuổi kiểm tra 56 con có 5/56 trâu (8,93%) con nhiễm tiên mao trùng. Trâu từ 5 đến 8 tuổi có 6/52 (11,54%) trâu nhiễm tiên mao trùng. Đối với những trâu trên 8 tuổi, qua kiểm tra thấy 7/54 (12/96%) con nhiễm tiên mao trùng.
6.98 8.93 11.54 12.96 0 2 4 6 8 10 12 14 ≤ 2 > 2 – 5 > 5 – 8 > 8 Tỷ lệ nhiễm (%)
Hình 4.2: Đồ thị tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi
Qua hình 4.2 ta thấy: tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu có xu hướng
tăng dần theo tuổi. Tỷ lệ nhiễm thấp nhất ở trâu dưới 2 năm tuổi 6,98%; trâu
từ 2 đến 8 năm tuổi có tỷ lệ nhiễm tăng lên 8,93% đến 11,54%; trâu trên 8
năm tuổi nhiễm tiên mao trùng với tỷ lệ cao nhất (12,96%). Kết quả của
chúng tôi phù hợp với nhận xét của Phan Lục và cs (1996) [16]: ở mọi lứa
tuổi trâu, bò đều bị nhiễm ký sinh trùng đường máu Trypanosoma, song tuổi
càng tăng thì tỷ lệ nhiễm càng tăng. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn
Thị Kim Lan và cs (2014) [12]: trâu nuôi tại 3 huyện Yên Sơn, Hàm Yên,
Chiêm Hóa của tỉnh Tuyên Quang nhiễm tiên mao trùng ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ
nhiễm tăng dần theo tuổi, đặc biệt là những trâu trên 8 tuổi nhiễm tiên mao
trùng nhiều nhất.
Trâu dưới 2 năm tuổi nhiễm tiên mao trùng với tỷ lệ thấp, do tuổi còn nhỏ, trâu chưa có nhiều thời gian tiếp xúc với côn trùng hút máu, ở tuổi này con vật chạy nhảy nhiều nên vật môi giới truyền bệnh khó bám và hút máu hơn. Đồng thời, khả năng tái tạo máu ở lứa tuổi này cũng nhanh hơn, nên khi nhiễm tiên mao trùng khả năng phục hồi cũng nhanh hơn lứa tuổi khác.
Giai đoạn từ 2 đến 8 tuổi, trâu ở nhiều địa phương thường chăn thả tập
