3. Bacillus cereus 1 Đặc điểm
4.3.2. Các phương pháp truyền thống:
Đặc điểm và nguyên tắc.
Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật trên các môi trường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các chủng, các loài vi sinh vật khác nhau.
Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên với nhóm phương pháp này còn một số hạn chế như độ nhạy không cao, tốn nhiều nhân công và thời gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa.
Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gây bệnh than cho người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng, B.mycoides, B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa. Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0.001% lysozyme, được trình bày trong bảng sau:
Đặc tính Loài
B.cereus B.thuringiensis B.mycoides B.anthracis B.megaterium
Gram +(a) + + + +
Di động +/-(b) +/- -(c) - +/-
Khử nitrate + + + + -(d)
Phân hủy tyrosine + + +/- -(d) +/-
Kháng lysozyme + + + + -
Phản ứng với lòng
đỏ trứng + + + + -
Lên men glucose + + + + -
Phản ứng VP + + + + -
Sinh acid từ manitol - - - - +
Tan máu (cừu) + + + -(d) -
Bảng: Các đặc tính của Bacillus nhóm I
a + :90 - 100% các chủng dương tính ; b +/- : 50% các chủng dương tính; c - : 90 – 100% : các chủng âm tính; d - : Hầu hết các chủng âm tính.
Do có hình thái đặc trưng trên các môi trường thạch chọn lọc như : Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP), Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymicin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA), nên B.cereus còn được phát hiện và định lượng bằng
môi trường này. Trên môi trường PEMBA, B. cereus tạo sản phẩm điển hình là những nhóm
có hình răng cưa và giữ lại màu xanh ngọc của chất chỉ thị pH (bromothymol blue) do chúng không có khả năng lên men mannitol, chúng bao quanh khu vực kết tủa lòng đỏ trứng được tạo ra bởi hoạt động của enzyme lecithinase. Trong môi trường PEMBA Pyruvate cải thiện các phản ứng kết tủa lòng đỏ trứng và peptone mức độ thấp làm tăng sự hình thành bào tử. Nhóm của B. cereus được xác định nhờ sự kết hợp một vết đen bào tử với một vết đen lipit ở trong tế bào. Bào tử màu xanh lá cây xuất hiện trong một tế bào thực vật cùng với tế bào chất màu đỏ và màu đen có chứa các giọt lipid.
Ngoài ra B.cereus cũng được định lượng bằng phương pháp MPN. Môi trường và hóa chất.
- Nước pepton đệm Bufered Peptone Water (BPW) - Thạch Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP)
- Thạch Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA) - Môi trường thạch Cereus Selective Agar (MOSSEL)
- Nhũ lòng đỏ trứng (Egg Yolk Emulsion), 50% - Canh Trypticase Soy Polymycin (TSP)
- Canh Phenol Red Glucose - Thạch Tyrosine
- Canh Lysozyme
- Môi trường thử nghiệm Voges-Prokauer - Canh Nitrate Broth
- Thạch dinh dưỡng Nutrient Agar cho B. cereus - Thạch máu Trypticase Soy Sheep
- Môi trường kiểm tra sự di động
- Thuốc thử nitrate ( dung dịch A, dung dịch B) - Hóa chất nhuộm Gram
Qui trình phân tích.
25g mẫu + 225ml môi trường pepton đệm (BPW) -> đồng nhất bằng Stomacher/ 1phút để có độ pha loãng 10-1 -> pha loãng thành dãy thập phân để có các độ pha loãng thích hợp.