3. Bacillus cereus 1 Đặc điểm
3.3.2. 1 Định lượng B.cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Phát hiện bằng môi trường chọn lọc.
Trải 0.1ml mỗi độ pha lỗng lên các mơi trường thạch MYP rồi ủ 24h ở 30oC: do
B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymicin nên khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa, chứng tỏ lecithinase được tạo thành.
Trường hợp sử dụng môi trường MOSSEL khuẩn lạc to, màu hồng, xung quanh có vịng sáng.
Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiên chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định B.cereus.
Các thử nghiệm khẳng định.
•Nhuộm Gram.
Cấy ria các khuẩn lạc được chọn từ môi trường MYP/MOSSEL sang ống thạch dinh dưỡng -> ủ ở 30oC/ 24h -> nhuộm Gram -> quan sát dưới kính hiển vi tế bào nhuộm bằng vật kính 100X nhúng trong dầu.
Quan sát dưới kính hiển vi cho ta thấy tế bào nhuộm Gram (+) có màu xanh tía, tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng. B.cereus là trực khuẩn lớn, Gram (+), thường kết hợp với nhau thành dạng chuỗi; bào tử hình bầu dục, khơng có dạng bào tử nang.
Hình 4: Kết quả nhuộm Gram của Bacillus cereus được quan sát dưới kính hiển vi Dùng que cấy vòng chuyển một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinh dưỡng vào 0.5ml BPW vơ trùng. Tạo huyền phù hóa dịch cho các phản ứng sinh hóa phía sau.
•Thử nghiệm lên men glucose
Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth -> ủ ở 35oC/ 24h, kị khí -> lắc mạnh ống nghiệm -> quan sát độ đục ( sự phát triển); sự chuyển màu mơi trường từ đỏ sang vàng (chứng tỏ có sự sinh acid trong điều kiện kị khí) thử nghiệm (+) với bacillus cereus.
Hình 5: Kết quả thử nghiệm lên men glucose
•Thử nghiệm khả năng khử nitrate.
Cấy vi khuẩn vào 5ml canh trường Nitrate Broth ủ 35oC/24h bổ sung vài giọt
dd của thuốc thử nitrate có màu cam xuất hiện trong 10phút (chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrit) thử nghiệm (+) với bacillus cereus.
Hình 6: Kết quả của thử nghiệm khả năng khử nitrate
Ống A đã cấy vi khuẩn trên canh trường Nitrate Broth chưa bổ sung thuốc thử.
Ống B và C có bổ sung thuốc thử alpha-naphthylamine và sulfanilic acid. Ống B cho kết quả dương tính (nitrate bị khử thành nitrite ), Ống C cho kết quả âm tính với nitrite.
•Thử nghiệm VP
Ở vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên men từ glucose qua con
đường đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là pyruvic acid. Để khôi phục dự trữ
NAD+ trong tế bào phục vụ cho con đường đường phân ở các lồi vi sinh vật, sau đó pyruvic
acid tiếp tục được chuyển hóa khác nhau tạo ra các sản phẩm lên men cuối cùng khác nhau. Họ Enterobacteriacceace có đặc tính chung là lên men sinh tổng hợp acid như acid formic,
acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 và CO2. Họ này có thể được chia thành hai nhóm là nhóm khơng sinh 2,3-butanediol (ví dụ : E.coli) và nhóm sinh 2,3-butanediol (ví dụ: Enterobacter). Phân tử 2,3-butanediol có thể được chuyển hóa qua lại thành acetoin: trong điều kiện có oxi và mơi trường có tính kiềm nhờ xúc tác của enzyme 2,3-butanediol dehydrogenase. Ngược lại acetoin có thể bị khử thành 2,3-butanediol do hoạt tính của enzyme diacetyl reductase; ngồi ra acetoin cịn bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử nghiệm VP.
Như vậy, thử nghiệm VP có thể giúp phân biệt các lồi trong Enterobacteriaceace dựa trên sự oxi hóa acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxi hóa acetoin thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của α-naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong peptone kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ. Trong thuốc thử Koblentz và O’Meara có chứa creatine có tác dụng bổ sung nguồn nhân guanidine.
Các bước tiến hành:
Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs (mơi trường MR-VP), có pH 6.9. Dùng que cấy vịng cấy vào các ống mơi trường MR-VP một ít sinh khối (trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz thì cấy nhiều sinh khối) từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24h trên môi trường KIA hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở
37oC / 24-48h hoặc đến 10 ngày. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống mơi
trường. Có 3 loại thuốc thử VP là:
• Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch
B là 40% KOH hoặc NaOH.
• Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn 95%, dung dịch B
là 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH.
• Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH
Khi sử dụng các loại thuốc thử 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường. Lắc nhẹ ống 1 phút để oxi hóa acetoin. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4h.
Thử nghiệm VP là (+) khi có màu đỏ trên bề mặt mơi trường, là (-) khi bề mặt mơi trường khơng đổi màu.
Hình 7: Kết quả thử nghiệm VP
• Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine.
Cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng tyrosine -> ủ 35oC/48h -> xuất hiện khuẩn lạc ( chứng tỏ tyrosine bị phân hủy) thử nghiệm (+) với bacillus cereus.
• Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth
Cấy vi khuẩn vào 2.5ml môi trường Nutrient Broth chứa 0.001% lysozyme, thực hiện tương tự với môi trường không chứa lysozyme -> ủ ở 35oC/24h -> kiểm tra sự tăng trưởng trong môi trường chứa và khơng chứa lysozyme -> những ống có kết quả âm tính ủ thêm 24h -> kết luận vi khuẩn có kháng lysozme hay khơng.
Kết luận: Dựa vào bảng Các đặc tính của bacillus nhóm I để khẳng định dịng đã chọn là B.cereus hay không.
Các thử nghiệm phân biệt các lồi trong Bacillus nhóm I.
Để phân biệt các lồi khác nhau trong Bacillus nhóm I cần tiến hành bổ sung các thử nghiệm sau:
•Thử nghiệm tính di động.
Phương pháp 1: Dùng que cấy vịng cấy thẳng dịch 24h ni vào giữa môi trường kiểm tra di động -> ủ 30oC/ 18-24h -> kiểm tra dưới ánh đèn kiểu mọc, dọc theo đừơng cấy.
Kết quả: loài di động mọc khuyếch tán vào môi trường theo hướng xa đường cấy,
lồi khơng di động mọc trong và dọc theo đường cấy
Hình 8: Kết quả thử nghiệm tính di động
Phương pháp 2: bổ sung 0.2ml nước cất vô trùng vào bề mặt môi trường thạch
nghiêng Nutrient Agar -> cấy huyền phù vi khuẩn vào -> ủ thạch nghiêng ở 30oC/6-8h -> nhỏ nước vơ trùng lên kính hiển vi, đặt sinh khối vi khuẩn vào -> quan sát dưới kính hiển vi để kiểm tra sự di động.
Hầu hết các chủng B,cereus, B.thuringiensis là di động; B.anthracis và B.mycoides khơng di động.
• Sự hình thành rễ giả
Chạm nhẹ que cấy vòng mang huyền phù 24 giờ lên giữa đĩa Nutrient agar -> ủ ở 30oC/48-72h -> kiểm tra sự phát triển của rễ giả (B.cereus không tạo cấu trúc rễ giả, thường tạo nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B.mycoides (cấu trúc giống như rễ hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy).
Hình 9: Bacillus cereus (khơng có cấu trúc rễ giả)
Hình 10: Bacillus Mycoides (có cấu trúc rễ giả)
• Thử nghiệm làm tan máu.
Cấy chủng lên mơi trường thạch máu Trypticase Soy -> ủ ở 35oC/24h -> B.cereus làm tan máu mạnh, tạo vùng tan máu hoàn toàn (β) 2-4 mm xung quanh vùng phát triển. B.thuringiensis và B.mycoides cũng tan máu β. B.anthracis thường không làm tan máu sau 24h.
Hình 11: Kết quả thử nghiệm làm tan máu
• Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể.
Cấy huyền phù tế bào 24h lên ống thạch nghiêng nutrient agar -> ủ 30oC/ 24h -> để yên ở nhiệt độ phòng /2-3ngày -> nhuộm bằng phẩm màu fuchsin -> quan sát dưới kính hiển vi.
Tinh thể độc tố của B.thuringiensis xuất hiện sau 3 đến 4 ngày nuôi cấy, phát hiện được bằng kỹ thuật nhuộm khi bào tử nang vỡ ra (tinh thể độc tố hình tứ giác dạng kim cương được nhuộm màu tối, nhỏ hơn bào tử). Do đó nếu khơng quan sát được bào tử tự do cần để thêm vài ngày rồi kiểm tra lại. B.cereus và các Bacillus khác cùng nhóm khơng tinh thể độc.
Cách tính kết quả.
Mật độ (CFU/ml)=Ai x Di /V Ai:số khuẩn lạc trung bình/đĩa
V: Dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
• Số tế bào B.cereus/1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc ở mỗi độ pha lõang và hiệu
chỉnh bằng tỉ lệ khẳng định (phần trăm khuẩn lạc được xác nhận là B.cereus).
Ví dụ: số khuẩn lạc đếm được ở độ pha lõang 10-4 là 65, có 4 trong 5 khuẩn lạc được
chọn xác nhận là B.cereus (được kiểm tra bằng các phản ứng sinh hóa).
• Số tế bào B.cereus/1g thực phẩm = 65 x 4/5 x 10000 x 10 = 5200000 (nhân 10 vì có
0.1 ml mẫu được trải đĩa).