3. Ý nghĩa khoa học của đề tài
2.2.THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI THỰC HIỆN
2.2.1. Thời gian
2.2.2. Địa điểm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
2.2.3. Phạm vi thực hiện
Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi thử nghiệm độc học cấp tính
của NaOCl trên một số loài cá có mặt ở nước, nhằm xác định giá trị LC50
trong 24h của NaOCl của từng loài để đánh giá sự nhạy cảm của từng loài đối với độc chất ô nhiễm.
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu tiến hành thí nghiệm độc học cấp tính của NaOCl trên 3
loài cá: cá Ngựa vằn (Danio rerio), cá Tứ vân (Puntius tetrazona), cá Hòa lan (Xiphophorus spp.) nhằm xác định nồng độ gây chết 50% sinh vật thử nghiệm
(LC50).
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Phương pháp hồi cứu tài liệu 2.4.1. Phương pháp hồi cứu tài liệu
Thu thập và tổng hợp thông tin từ các nguồn tài liệu về sinh vật cảnh báo, phương pháp thử nghiệm độc học cấp tính, phương pháp giám sát sinh học, hệ thống cảnh báo sớm ô nhiễm nguồn nước dựa trên hành vi phản ứng của sinh vật và các nghiên cứu về các loài cá được sử dụng trong thử nghiệm.
2.4.2. Phương pháp thí nghiệm
a) Vật liệu thí nghiệm
Hóa chất: Hóa chất sử dụng là Natri hypochlorite (NaOCl) tinh khiết. Nước thí nghiệm: Sử dụng nước cấp của thành phố Đà Nẵng, nước được để trên 24h khử bớt Clo trước khi dùng.
Cá: được mua từ cửa hàng cá cảnh, thuần dưỡng trong bể 80 lít trong vòng 1 tuần. Trước khi làm thí nghiệm, ngừng cho ăn một ngày để hạn chế phân cá làm ô nhiễm nước.
Hồ chứa cá: Thí nghiệm sử dụng 24 hộp nhựa có nắp đậy, kích thước: chiều ngang 15 cm, chiều dài 25 cm và cao 20 cm chứa 3 lít nước trong mỗi lô thí nghiệm.
b) Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm thăm dò
Để xác định được ngưỡng chịu đựng của từng loài cá đối với NaOCl, tiến hành thí nghiệm thăm dò
Thí nghiệm được tiến hành trên hồ chứa 3 lít nước, mật độ cá là 4 con/ bể, ở từng nồng độ không có sự lặp lại. Sục khí liên tục trong 24h để đảm bảo cá đủ oxy, không thay nước và không cho cá ăn trước khi thực hiện thí nghiệm 1 ngày và trong quá trình thực hiện thí nghiệm. Thí nghiệm được theo dõi và khi phát hiện cá chết, ghi nhận số liệu rồi vớt cá ra để hạn chế ảnh
hưởng đến chất lượng nước.
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm thăm dò của cá Ngựa vằn
Bố trí thí nghiệm với các dãy nồng độ theo bảng 2.1., các dãy nồng độ này được xác định dựa trên những nghiên cứu liên quan trước đây.
Bảng 2.1. Dãy nồng độ NaOCl (mg/L) trong thí nghiệm thăm dò
Cá Ngựa vằn Cá Tứ vân Cá Hòa lan
23,67 33,33 43,33 30,00 40,00 46,67 36,67 50,00 53,33 41,67 55,00 60,00 43,33 60,00 67,67 48,33 67,67 70,00 58,33 83,33 83,33 61,67 100,00 100,00 Thí nghiệm xác định LC50-24h
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (RCD) với các nồng độ được xác định từ thí nghiệm thăm dò, tiến hành thí nghiệm với dãy năm nồng độ natri hipoclorit (NaOCl) (dãy nồng độ được trình bày ở bảng 2.2.) và đối chứng. Với mỗi nồng độ lặp lại 4 lô, mỗi lô có 10 con cá/3lít nước. Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp tĩnh trong 24h, sục khí thường xuyên. Thí nghiệm được theo dõi và khi phát hiện cá chết, ghi nhận số liệu rồi vớt cá ra để hạn chế ảnh hưởng đến chất lượng nước.
Bảng 2.2. Kí hiệu các lô thí nghiệm
(Chú thích: NVĐ 1, 2, 3, 4: là 4 lô cá Ngựa vằn đối chứng; NV 1.1, 1.2, 1.3, 1.4: là 4 lô cá Ngựa vằn ở nồng độ NaOCl thứ nhất, tương tự với các nồng độ tiếp theo. Cá Tứ vân (TV), Hòa lan (HL) kí hiệu tương tự như cá Ngựa vằn.) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhiệt độ, oxy hòa tan, pH được đo lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm trong ngày thực hiện thí nghiệm, để theo dõi sự ảnh hưởng của các yếu tố đến kết quả thí nghiệm [40], [47]. Các yếu tố này được đo bằng máy đo đa chỉ tiêu nước YSI 6920 V2.
Thí nghiệm được thực hiện theo hướng dẫn của OECD (Organization for Economic Cooperation and Development) về hóa chất và cá trong thí nghiệm độc tính cấp tính [47].
2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê. So sánh giá trị trung bình bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA), kiểm tra LSD (α = 0,05) và phân tích tương quan hồi qui bằng phần mềm Microsoft Excel.
Cá Ngựa vằn Cá Tứ vân Cá Hòa lan
Nồng độ NaOCl (mg/L) Kí hiệu Nồng độ NaOCl (mg/L) Kí hiệu Nồng độ NaOCl (mg/L) Kí hiệu 0 NVĐ 1, 2, 3, 4 0 TVĐ 1, 2, 3, 4 0 HLĐ 1, 2, 3, 4 33,33 NV 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 40,00 TV 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 50,00 HL 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 40,00 NV 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 56,67 TV 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 53,33 HL 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 51,67 NV 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 70,00 TV 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 76,67 HL 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 53,33 NV 4.1, 4.2, 4.3, 4.4 90,00 TV 4.1, 4.2, 4.3, 4.4 96,67 HL 4.1, 4.2, 4.3, 4.4 58,33 NV 5.1, 5.2, 5.3, 5.4 100,00 TV 5.1, 5.2, 5.3, 5.4 113,33 HL 5.1, 5.2, 5.3, 5.4
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM THĂM DÒ
Thí nghiệm thăm dò được tiến hành để xác định tương đối ngưỡng chịu đựng của từng loài cá đối với NaOCl. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ lệ cá chết ở các nồng độ NaOCl trong thí nghiệm thăm dò
Cá Ngựa vằn Cá Tứ vân Cá Hòa lan
Nồng độ NaOCl (mg/L) Tỷ lệ cá chết (%) Nồng độ NaOCl (mg/L) Tỷ lệ cá chết (%) Nồng độ NaOCl (mg/L) Tỷ lệ cá chết (%) 23,67 0 33,33 0 43,33 0 30,00 0 40,00 0 46,67 0 36,67 50 50,00 25 53,33 0 41,67 25 55,00 25 60,00 50 43,33 50 60,00 75 66,67 25 48,33 75 67,67 50 70,00 50 58,33 100 83,33 75 83,33 50 61,67 100 100,00 100 100,00 75
Dựa vào bảng 3.1. cho thấy, ở 2 nồng độ NaOCl dưới 30,00 mg/L không có con cá Ngựa vằn nào chết, còn ở 2 nồng độ cao từ 58,33 mg/L trở lên cả 4 con cá chết dùng thử nghiệm đều chết hết trong 24h. Do đó nghiên
cứu xác định dãy 5 nồng độ để tiến hành thí nghiệm LC50 của cá Ngựa vằn
nằm trong khoảng từ 30,00 đến 58,33 mg/L.
Cá Tứ vân có ngưỡng chịu đựng cao hơn, đến nồng độ 100,00 mg/L cả 4 con cá trong hồ đều chết trong 24h, và không có con nào chết ở nồng độ từ 40,00 mg/L trở xuống. Vì vậy xác định được khoảng để chọn dãy nồng độ là từ 40,00 – 100,00 mg/L.
Trong 3 loài được chọn tiến hành thí nghiệm thì cá Hòa lan có sức chịu đựng cao nhất, ở ngưỡng nồng độ 100,00 mg/L mà chỉ có ¾ số cá chết, tức là 75% số cá thể thí nghiệm. Do đó trong dãy 5 nồng độ phải có những nồng độ
cao hơn 100,00 mg/L và nồng độ thấp nhất có thể chọn là 53,33 mg/L. Tuy nhiên đến nồng độ 60,00 mg/L cá chết đến 50% vậy nên chọn nồng độ thấp nhất khoảng từ 46,67 mg/L trở lên vì có thể thấy cá tỷ lệ cá chết còn chịu yếu tố khác ngoài nồng độ độc chất tăng. Vì vậy khi tiến hành thí nghiệm để xác
định giá trị LC50, phải tiến hành theo dõi các yếu tố lý hóa như nhiệt độ nước,
oxy hòa tan và pH đồng thời có những lô thí nghiệm đối chứng. Để đảm bảo kết quả không bị ảnh hưởng bởi những yếu tố ngoại cảnh.
3.2. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM XÁC ĐỊNH LC50
3.2.1. Nhiệt độ, pH và oxy hòa tan trong thời gian làm thí nghiệm xác
định LC50
Khi tiến hành thí nghiệm xác định LC50 cần phải đo đạt các yếu tố hóa
học, vật lí như oxy hòa tan, nhiệt độ, pH vào lúc bắt đầu tiến hành và kết thúc thí nghiệm, nhằm theo dõi sự ảnh hưởng của các yếu tố này .đến kết quả thí nghiệm, kết quả thu được thể hiện ở các bảng dưới đây:
Bảng 3.2. Nhiệt độ trong thí nghiệm LC50 (oC)
Nghiệm thức
Cá Ngựa vằn Cá Tứ vân Cá Hòa lan Bắt đầu Kết thúc Bắt đầu Kết thúc Bắt đầu Kết thúc Đối chứng 26,25±0,96 27,00±1,15 27,25±0,96 28,00±0,82 24,50±1,29 26,50±1,29 1 27,00±0,82 27,25±0,96 27,25±0,50 27,75±0,50 24,50±1,29 25,25±1,26 2 26,50±1,29 27,25±1,71 27,75±0,50 28,25±0,96 26,25±1,50 24,50±1,29 3 27,00±0,82 27,50±1,29 27,50±0,58 28,50±0,58 25,00±0,82 25,50±1,29 4 27,50±1,29 27,50±0,58 27,75±0,96 27,75±0,50 25,75±1,71 26,00±0,82 5 26,50±1,29 27,50±1,00 27,75±0,50 28,50±0,58 25,50±0,58 26,75±1,26
Trong thời gian thí nghiệm ở cả 3 loài cá, yếu tố nhiệt độ của nước lúc bắt đầu thí nghiệm luôn thấp hơn lúc kết thúc thí nghiệm, nhưng dao động không quá lớn. Nhiệt độ nước ở các nghiệm thức có chứa NaOCl so với đối chứng cũng không có sự khác biệt lớn. Theo bảng 3.2 ta thấy, nhiệt độ trung bình trong các nghiệm thức thí nghiệm ở cá Ngựa vằn và cá Tứ vân điều nằm
không ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý của cá. Tuy nhiên ở thí nghiệm cá Hòa lan nhiệt độ trung bình khi tiến hành thí nghiệm cao hơn khoảng nhiệt độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thích hợp là 18 - 25 oC [9] nhưng cá ở các lô đối chứng không bị chết nên
chứng tỏ ở nhiệt độ này cũng không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Bảng 3.3. Nồng độ oxy hòa tan trong thí nghiệm LC50 (mg/L)
Nghiệm thức
Cá Ngựa vằn Cá Tứ vân Cá Hòa lan Bắt đầu Kết thúc Bắt đầu Kết thúc Bắt đầu Kết thúc Đối chứng 7,03±0,21 7,13±0,17 6,93±0,19 7,03±0,28 7,10±0,18 6,98±0,17 1 6,90±0,14 6,95±0,13 6,83±0,25 6,88±0,17 6,93±0,26 7,00±0,16 2 6,95±0,13 7,00±0,22 6,90±0,08 6,90±0,18 6,95±0,21 6,73±0,17 3 6,90±0,18 7,05±0,13 6,88±0,22 6,98±0,17 7,05±0,26 6,83±0,17 4 7,00±0,18 7,08±0,13 6,95±0,13 7,00±0,18 7,15±0,39 6,88±0,28 5 6,95±0,13 6,85±0,26 6,88±0,17 6,83±0,24 7,05±0,24 6,63±0,15
Theo bảng 3.3 cho thấy, nồng độ oxy hòa tan (DO) lúc bắt đầu và kết thúc các thí nghiệm với Cá Ngựa vằn, Cá Tứ vân, Cá Hòa lan lần lượt dao động trong khoảng 6,90±0,18 - 7,13±0,17; 6,83±0,25 - 7,03±0,28; 6,63±0,15 - 7,15±0,39 mg/L. Sở dĩ DO cao như vậy là vì các lô thí nghiệm được sục khí liên tục 24/24h, nhằm đảm bảo khí oxy cho cá sinh sống bình thường.
Bảng 3.4. pH trong thí nghiệm LC50
Nghiệm thức
Cá Ngựa vằn Cá Tứ vân Cá Hòa lan Bắt đầu Kết thúc Bắt đầu Kết thúc Bắt đầu Kết thúc Đối chứng 6,98±0,11 7,06±0,19 7,06±0,15 7,09±0,14 6,98±0,27 6,97±0,17 1 7,07±0,21 7,25±0,15 7,23±0,24 7,25±0,16 7,14±0,13 7,21±0,06 2 7,26±0,07 7,25±0,23 7,37±0,13 7,28±0,24 7,13±0,19 7,16±0,12 3 7,36±0,16 7,40±0,12 7,39±0,19 7,37±0,15 7,30±0,10 7,23±0,07 4 7,41±0,19 7,53±0,18 7,40±0,20 7,54±0,26 7,40±0,15 7,27±0,08 5 7,51±0,13 7,57±0,17 7,61±0,13 7,54±0,23 7,24±0,14 7,38±0,12
Giá trị pH khi bắt đầu và kết thúc thí nghiệm ở các lô đối thấp hơn ở các nghiệm thức chứa độc chất NaOCl được trình bày ở bảng 3.4. Nguyên nhân là do NaOCl hòa tan trong nước tạo môi trường bazơ dẫn đến nồng độ NaOCl càng cao thì pH càng lớn. Các giá trị pH lớn nhất ở các lô thí nghiệm
là 7,57±0,17 đối với cá Ngựa vằn, cá Tứ vân là 7,61±0,13 và cá Hòa lan là 7,40±0,15. Tuy nhiên các khoảng pH này nằm trong giới hạn sinh thái theo Vũ Cẩm Lương (2009) là cá Ngựa vằn từ 6 - 8; cá Tứ vân 6,0 - 7,5; cá Hòa lan 7,0 - 8,3 [9].
So sánh lần lượt kết quả của các yếu tố nhiệt độ và pH này với nghiên
cứu của Nguyễn Văn Công và cs. về xác định giá trị LC50 - 96h của
Cypermethrin trên cá Rô đồng (Anabas testudineus) thì các yếu tố nhiệt độ và
pH lần lượt là 27,4±0,04 oC - 30 oC ; 7,4±0,05 - 7,5±0,05 gần như tương đồng
nhau, không có sự sai khác quá lớn. Tuy nhiên ở nghiên cứu Nguyễn Văn Công và cs. nhằm mục đích quan sát tần suất đớp khí trời của cá Rô nên không sục khí trong khi tiến hàtnh thí nghiệm nên giá trị DO chỉ dao động từ 3,8±0,06 - 4,0±0,05 mg/L vào buổi sáng và buổi chiều từ 3,8±0,11 - 4,2±0,16 mg/L thấp hơn nhiều so với nghiên cứu này. Hay trong nghiên cứu của Anandhan R. và Hemalatha S. (2008) về thử nghiệm độc tính cấp tính của
Nhôm (Al) trên cá Ngựa vằn thì các yếu tố nhiệt độ, pH, DO lần lượt là 28 oC;
6,8; 5,96 mg/L trong nước có chứa Al cũng không có sự khác biệt lắm so với kết quả của nghiên cứu này [15].
Nhìn chung, các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện ổn định ở tất cả các lô thí nghiệm; nhiệt độ, oxy hòa tan, pH đều nằm trong khoảng thích hợp của cả 3 loài cá kể trên.
3.2.2. Biểu hiện của cá trong thời gian thí nghiệm và giá trị LC50 của NaOCl NaOCl
a) Cá Ngựa vằn
Sau khi tiếp xúc với hóa chất, cá ở những nồng độ thấp trong 15 phút đầu chưa có biểu hiện gì bất thường, nhưng ở nồng độ cao nhất là 58,33 mg/L, cá đã có hiện tượng mất thăng bằng khi bơi lội, nhảy búng lên khỏi mặt nước, bơi nhanh, và loạn, sau đó bơi chậm dần, có hiện tượng co giật trên mặt nước rồi chết sau khi có biểu hiện bất thường 15 - 20 phút. Còn ở các nồng độ thấp hơn, khoảng 2 – 3h sau một số con cũng có biểu hiện tương tự như bơi nhanh, va đầu vào thành hồ như đang tìm cách trốn thoát khỏi môi trường. Các hiện tượng này cũng diễn ra tương tự khi so sánh với các kết quả nghiên cứu của Anandhan R. và Hemalatha S. (2008) tiến hành trên cá Ngựa vằn với chất độc
là Al3+ [15], các nghiên cứu nước ngoài khác với thuốc trừ sâu hay các chất ô
nhiễm khác trên các loài cá khác [37], [44], [49], và nghiên cứu của Nguyễn Văn Công và cs. về ảnh hưởng thuốc trừ sâu lên cá Rô đồng tại Việt Nam [13].
Hình 3.1. Cá Ngựa vằn trong thí nghiệm
Phân tích các yếu tố khác nhau liên quan đến việc thay đổi hành vi của cá thì nó xuất hiện ngay khi cá phải đối mặt với các môi trường không thuận lợi, cá phải nỗ lực hết sức nhưng do hạn chế về năng lượng cần thiết nên xu
hướng di chuyển xuống thấp dần, và những nỗ lực chỉ kéo dài được trong một khoảng thời gian ngắn và cuối cùng chúng cũng chết [15].
Sau 24h tiếp xúc với hóa chất, ở nghiệm thức đối chứng ghi nhận không có cá chết, ở nồng độ thấp nhất (33,33 mg/L) cá chết khoảng 2,5%. Tỷ lệ cá chết tăng dần theo nồng độ NaOCl theo trình tự nồng độ càng cao tỷ lệ cá chết càng nhiều (Bảng 3.5) và cá chết nhiều nhất ở nồng độ cao nhất (58,33 mg/L) là 57,5% .
Bảng 3.5. Tỷ lệ cá Ngựa vằn chết theo nồng độ NaOCl và giá trị LC50
Nồng độ (mg/L) ĐC 33,33 40,00 51,67 53,33 58,33 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phần trăm cá chết (%) 0 2,50 10,00 22,50 30,00 57,50
LC50 (mg/L) 57,02
Hình 3.2 thể hiện phần trăm cá chết thuận tỷ lệ với nồng độ thông qua đồ thị logarit. Thiết lập được phương trình Logarit Nepe giữa tỷ lệ cá chết (x) và nồng độ NaOCl (y), ta tính được nồng độ gây chết 50% số cá thể thử
nghiệm (LC50) của cá Ngựa vằn được trình bày ở bảng 3.5.
Hình 3.2. Biểu đồ đường cong phần trăm cá Ngựa vằn chết phụ thuộc vào nồng độ NaOCl trong 24h.
y = 8,387ln(x) + 24,208 R² = 0,9609 0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 Nồng đ ộ NaOCl (m g/l ) Phần trăm cá chết (%) Biểu đồ LC50của cá Ngựa vằn
Kết quả tính toán cho thấy nồng độ gây chết 50% của NaOCl lên cá Ngựa vằn sau 24h là 57,02 mg/L cao hơn so với nghiên cứu của Magalha và cs. (2007) là 48 mg/L cũng trên cá Ngựa vằn [23]. Điều đó có thể được giải thích vì sự khác nhau giữa 2 dòng cá khác nhau ở 2 nước (Việt Nam và Brazil), khiến cho cá có khả năng chống chịu với chất ô nhiễm khác nhau.
b) Cá Tứ vân
Tương tự như thí nghiệm trên đối với cá Ngựa vằn, sau khi tiếp xúc với hóa chất, cá trong các lô có nồng độ NaOCl cao (90 và 100 mg/L) bơi nhanh hơn, một vài con có hiện tượng lao đầu vào thành bể. Khoảng 30 phút tiếp