III. HPLC ĐIỀU CHẾ
5. Lựa chọn dung môi Thay đổi dung môi:
Pha thuận thường được chạy với dung môi hữu cơ, thường là hexane, heptane, cyclohexane hay halocarbon như DCM, Cloroform. Pha động rửa giải thường là 1 dung môi thân nước, như nước, ester. Acid hữu cơ thường thêm vào để giảm thiểu hiệu ứng trao đổi ion do những nhóm silanol. Rửa giải đẳng dòng với hỗn hợp butanol, acid acetiic và nước là giao thức chuẩn cho sự tách giải các acid amin và 1 hỗn hợp methanol, cloroform, nước hữu dụng cho hợp chất hữu cơ nói chung. Peptide dễ dàng được tinh chế bằng rửa giải kiểu gradient trên silica pha thuận, tăng dần
từ acetonitrile tới pha động có nước. Kĩ thuật này đặc biệt hiệu quả với những peptide rất phân cực khó phân lập trên sắc kí pha đảo.
Pha đảo hoạt động trong môi trường đệm thân nước, nơi hấp phụ kị nước giữa chất phân tích và pha tĩnh bị xáo trộn bới sự tăng dần nồng độ 1 dung môi hữu cơ có thể hỏa lẫn. Ứng dụng phổ biến của HPLC pha đảo là trong tinh chế peptides và protein, trong đó chất phân tích thường được giả hấp bởi sự rửa giải gradient. Đệm chạy thân nước phổ biến nhất thường là nước chứa hàm lượng thấp của axit trifluoroacetic (thường là 0,1% v / v) và các pha động rửa giải thường là acetonitrile- chất điều chỉnh độ phân cực- chứa axít trifluoroacetic.
Các trifluoroacetic axit phục vụ hai mục đích: trước hết, nó tạo một cặp ion mạnh với chất phân tích, như vậy chống lại việc trao đổi cation với bất kỳ nhóm silanol tự do nào trên giá mang silica; và thứ nhì, với vai trò các cặp ion, nó làm giảm sự thay đôi cấu trúc protein và peptide và do đó cải thiện hình dạng peak. Lợi điểm của axit trifluoroacetic ở chỗ nó không hấp thu UV- kĩ thuật chính trong phát hiện peptide và nhiều phân tử khác. Các đệm acid khác như phosphate, acetate and hydrochloride cũng thường được dùng. Ethanol, methanol, tetrahydrofuran, pro- pionitrile và propan-2-ol cũng thường được dùng với vai trò chất điều chỉnh độ phân cực, nhưng chúng không tốt bằng acetonitrile.
Silica pha đảo không ổn định trong môi trường kiềm do sự mất các gốc ankyl và sự hòa tan của silica khi hoạt động lâu ở pH cao. Với pha tĩnh polymer lỗ lớn ổn định ở pH cao (macroporous polymeric stationary phases) có thể mở rộng khoảng pH hoạt động của pha đảo trong khoảng 1- 14. Pha đảo polymer thường dùng nhất là loại polymer trùng hợp từ styrene và divinyl benzene. Tính kị nước của pha tĩnh này là do mạch polymer dài và vòng benzene, vì thế quá trình rửa giải dự đoán sẽ khác với pha tĩnh silica C18 chẳng hạn. Thực tế, trên dữ liệu rửa giải nhiều chất, trình tự rửa giải và thời gian rửa giải quan sát được trên pha tĩnh polymer chất lượng cao thường tương tự kết quả thu được từ pha tĩnh silica chất lượng cao.