II. SẮC KÝ CỘT ĐIỀU CHẾ
11. SẮC KÝ LỎNG CHÂN KHÔNG
Sắc ký lỏng chân không ( VLC) có nguồn gốc từ Úc. Vào năm 1977, một mô tả ngắn về phương pháp phân lập cembrenoid terpene từ san hô mềm của Úc đã được xuất bản.
11.1. Nguyên tắc:
Kỹ thuật này có thể được xem như sắc ký lỏng chế hóa, hoạt động như một cột, dùng chân không để tăng tốc độ chảy của chất rửa giải. Kỹ thuật này khác với sắc ký cột nhanh là cột được chạy khô sau khi thu mỗi phân đoạn. Điều này giống sắc ký lớp mỏng chế hóa vì các đĩa được làm khô sau khi chạy và sau đó được rửa giải lại.
11.2. Quy trình:
Một cột nhỏ hoặc một phễu lọc Buchner vừa với thủy tinh ( 10-20 µm, độ xốp D hay 2) được gắn khô với chất hấp thụ ( 10-40 µm của loại sắc ký lớp mỏng, ví dụ như silicagel Merck 60 H hay 60 G).
Chất hấp thụ được cho vào bằng cách gõ nhẹ dưới trọng lực. Sau đó đưa chân không vào thông qua vòi 3 ngã, chất hấp thụ được nén xuống thành một lớp mỏng cứng bằng cách đè một nút chặn cao su và gõ nhẹ.
Tắt chân không, rót dung môi kém phân cực nhanh lên trên bề mặt chất hấp phụ, sau đó mở chân không. Khi mà chất rửa giải đi qua, cột được hút khô và sẵn sàng để tải.
Mẫu trong dung môi thích hợp được cho trực tiếp phía trên đầu cột và được kéo nhẹ nhàng vào vật hứng bằng chân không. Mẫu được tái hất thu trên silicagel, nhôm oxide.
Cột được triển khai với hỗn hợp dung môi thích hợp, bắt đầu với dung môi kém phân cực, tăng dần độ phân cực, rút cho cột khô giữa mỗi phân đoạn thu được ( điều này tránh tạo rãnh).
Ngược với phương pháp sử dụng áp suất phía trên đầu cột, sự lôi kéo trên cột VLC thì dễ dàng vì phía trên đầu cột bằng với áp suất khí quyển.
Nhìn chung, chiều cao cột hấp thụ không nên quá 5 cm. Với lớp nhỏ ( < 100 mg), thích hợp với cột .5-1 cm i.d. và cao 4 cm, đối với 0.5-1g, thích hợp kích thước 2.5*4 cm, từ 1-10 g, 5*5 cm, với lượng lớn hơn thì được phân lập tốt nhất với phễu lọc thủy tinh nung với chiều cao 5 cm. Hỗn hợp để phân lập được thêm vào cột silic ở bất cứ vị trí nào có thể với một ít dầu hỏa ( nếu không thể làm như trên thì thêm vào một chất rắn). Tăng lượng dung môi phân cực hơn cho mỗi phân đoạn dung môi liên tiếp. Tăng độ phân cực một lượng nhỏ (1%,2%, 3%), sau đó lượng tăng có thể tới 5%, 10%, 20%.
11.3. Các ứng dụng:
Sắc ký lỏng chân không được dùng để phân lập từng phần dịch chiết dược liệu trước khi dùng HPLC và các bước phân lập phức tạp khác. Trong những năm trước VLC được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực sản phẩm tự nhiên vì cơ chế hoạt động đơn giản. Những chất hỗ trợ sắc ký khác được sử dụng trong VLC: silicagel ( cả loại thường và loại pha đảo), Al2O3, CN, diol và polyamide. Chất rửa giải phổ biến nhất là ether dầu hỏa, tăng thành phần ethyl acetate.
Alkaloid
Việc tinh khiết hóa aconitine thương mại bằng VLC thì nhanh hơn, rẻ hơn và thuận tiện hơn bằng sắc ký lớp mỏng chế hóa, yếu tố quan trọng nhất, rõ nhất là việc rữa giải mẫu bởi VLC mà không cần phải cạo đĩa.
Những phân lập về diterpene alkaloids dùng VLC trên Al2O3 đã được báo cáo ( Pelletier and Badawi 1987; Joshi et al. 1990: Liang et al. 1991). Trong những ví dụ này thì có sự kết hợp VLC và CTLC.
Một alkaloid guanidine độc mới được phân lập từ bọt biển lục địa Anchinoe paupertas bởi một quy trình bao gồm VLC trên diol, với dichloromethane-methanol ( 10:05:5) ( Bouaicha et al. 1994)
Diterpene
Dầu hạt của Croton tiglium chứa phorbol-12,13-diester được biết như là chất dị ứng và gây ung thư. Những diesters này được tinh khiết hóa trên silicagel 60( 15-40 µm, Merck) với máy VLC được sữa đổi dùng dòng dung môi không đổi và chân không.
Isobenzofuranones
Dịch chiết từ rễ Polygonum multiflorum được sử dụng trong thuốc cổ truyền Trung Quốc trị bệnh tim mạch. Dịch chiết methanol của rễ được chia ra giữa nước và ethyl acetate. Phần ethyl acetate được sắc ký bởi VLC trên một giá sâu 2.5 cm theo loại silicagel 60H của sắc ký lớp mỏng pha đảo, Merck ( số 7716) ( trong một phễu Buchner đường kính 13.7 cm, thủy tinh xốp loại 3).
Triterpen Glcosides
Oleanolic acid saponin của cây Dialium guineense được phân lập từ quả bởi quy trình đầu tiên là sắc ký cột nhanh trên silicagel và sau đó là VLC trên lichoprep RP-18 với methanol 7:4. ( Odukova et al. 1996)
Limonoids
Azadirone được phân lập từ nhân hạt chưa chín của Trichilia havanensis. Dịch chiết hexane của nhân được chia ra giữa hexane và methanol-nước 19:1. Dung dịch methanol nước được chiết với ethyl acetate và VLC của dịch chiết sau trên silicagel tái hoạt hóa với 5% nước ( rửa giải với dầu hỏa-ethyl acetate 19:1) thu được trực tiếp limonoid( Arenas and Rogriquez-Hahn 1990)
Xanthones
5 xanthones được phân lập từ Garcinia cowa bởi quy trình gồm các bước phân lập chủ yếu của VLC. Dịch chiết methanol của vỏ được phân lập thành 8 phân đoạn bởi VLC trên silicagel ( 80g), rửa giải thường xuyên với hexane, hỗn hợp hexane-benzene và dichloromethane. Các
xanthones có thể thu được bằng cách kết tinh trực tiếp từ các phân đoạn hay từ sắc ký lớp mỏng ly tâm liên tục. Cowanol cho thấy hoạt tính kháng khuẩn trung bình với Staphylococcus areus ( Na Pattalung et al. 1994)
Iridoids
Việc áp dụng VLC để phân lập các iridoid khác nhau đã được báo cáo bởi Handjieva et al.( 1991 a,b). Với mục đích này, cả nhôm trung tính 60G ( 5-40 µm, Merck 1090), Silicagel sắc ký lớp mỏng 60H ( 15 µm, Merck 11695), hoặc Florisil ( 10-63 µm, Merck 12519 ) và phễu lọc Buchner với đường kính khác nhau ( tùy theo kích thước mẫu) đã được sử dụng. Một số biến đổi nhỏ về phương pháp của Coll và Bowden ( 1986) đã được thực hiện, đun nóng chất hấp thụ và sử dụng một lớp nổi bằng nhựa bên trên phần hỗ trợ.
Ví dụ:
-Mẫu là dịch chiết dichloromethane từ rễ khô của Centrathus ruber.
-So sánh giữa VLC và sắc ký lớp mỏng chế hóa cho việc phân lập valepotriates từ Valeriana oficinalis cho thấy những thuận lợi của VLC: thời gian phân tích ngắn hơn 6 lần, ít hơn 6 lần dung môi, chất hấp thụ có thể tái sử dụng 6-7 lần, hơn nữa VLC thu được valepotriate ít bị biến chất hơn so với sắc ký cột mở.
-Secoiridoid glucosides gentiopicroside và swertiamarin thu được ở dạng tinh khiết từ rễ tươi của Gentiana punctata sau khi dùng VLC.
Ngoài ra việc phân lập iridoid glycosides bằng VLC bao gồm các báo cáo bởi Boros at al. ( 1990,1991), Akunyili et al. ( 1991) và Justice et al. ( 1992). Trong một ứng dụng được báo cáo bởi Boros et al.( 1990), “ mini-VLC” trên pipet Pasteur có sẵn được dùng để phân lập số lượng nhỏ nguyên liệu
Flavonoid glycosides
Trong việc phân lập một flavonol glycoside mới ( kaempferol-3-(2,3-diacetoxy-4-p-coumaroyl) rhamnoside) từ lá của Myrica gale, bước tinh khiết hóa ban đầu là VLC trên polyamide-TLC 6 AC ( Macherey-Nagel), rửa giải với 50 ml, ước số của methanol-nước với độ phân cực tăng dần ( methanol-nước 1:1Methanol 100%) ( Carton et al. 1990)
Acetylenic Alcohols
VLC trên pha khung cyano ( 40 µm) được sử dụng để phân lập acetylenic alcohols gây độc tế bào từ bọt biển Cribrochalina vasculum ( Hallock et al.1995). Chiết xuất bọt biển thô được rửa giải trong VLC với gradient của t-butyl methyl ether-hexanes: HPLC pha đảo thì cần thiết cho giai đoạn phân lập cuối của các alcohols chuỗi dài.
Polyacetylenes
Một polyacetyllene độc tế bào, (-)-17-hydroxy-9,11,13,15-octadecatetraynoic aicd được phân lập từ Minquartia guianensis, một cây từ Ecuador. Vỏ thân cây được chiết xuất với các dung môi có độ phân cực tăng dần và dịch chiết chloroform được cho là có hoạt tính chống lại tế báo ung thư máu lympho P-388 ở chuột. Dịch chiết này trước tiên được sắc ký với sắc ký cột mở và phân đoạn hoạt tính là mẫu cho VLC trên mộtt cột 8*40 cm của silicagel 70-230 mesh. Sau khi rửa giải với chloroform- ethylacetate- methanol ( 18:1:1) và cuối cùng kết tinh thu được polyacetylene có hoạt tính.
Kawalactones
Dịch chiết của lá Cryptocarya kurzii ( Lauraceae) với ethanol thu được cặn, cặn này độc với tế bào KB. Hỗn hợp có hoạt tính này, một lacton loại kawa mới, kurzilactone, thu được bằng cách kết hợp VLC, sắc ký lớp mỏng chế hóa, HPLC pha đảo. Silicagel 60H ( 70-230 mesh) được sử dụng cho VLC, với dichloromethane-methanol ( 100:0, 99:1, 99:2, 19:1, 9:1) như là chất rửa giải. ( Fu et al. 1993)