2.3.2.1 Màng lọc tẩm nano bạc tiếp xúc trực tiếp với dịch vi khuẩn
Màng lọc ngay sau khi tẩm nano bạc được cho tiếp xúc với dịch vi khuẩn
E.Coli để đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng lọc. Xác định một cách định
tính khả năng kháng khuẩn của màng lọc phủ nano bạc bằng cách quan sát vòng kháng khuẩn xung quanh các màng lọc phủ nano bạc và đối chứng khi đặt các màng
lọc này tiếp xúc với môi trường chứa E.Coli. Sau đó định lượng khả năng kháng khuẩn của các màng lọc này bằng cách xác định % lượng vi khuẩn E.Coli bị tiêu
diệt sau khi tiếp xúc với màng lọc tẩm nano bạc, có so sánh với mẫu đối chứng (mẫu không phủ nano bạc).
* Hóa chất và dụng cụ:
+ Hóa chất: - Môi trường Chromocult – môi trường đặc trưng để phân lập
32
- Màng lọc tinh phủ và không phủ nano bạc.
+ Dụng cụ: - Đĩa petri đường kính 9cm, pipet, kéo, đèn cồn, bông không thấm…,
- Tủ cấy vô trùng (Đài Loan), tủ nuôi ủ vi sinh FFC 90E VELP, nồi hấp tiệt trùng 25X-2 (Mỹ), tủ sấy Memmert (Đức), cân phân tích DJ-300TW (Nhật), máy lắc Votex VX-100 Labnet (Mỹ).
a) Quan sát vòng kháng khuẩn của màng lọc tẩm nano bạc Phương pháp tiến hành:
+ Pha chế môi trường E.Coli, khử trùng và làm nguội đến 50°C, đổ ra đĩa petri
trong điều kiện vô trùng (tủ cấy), mỗi đĩa khoảng 12 - 15 ml, để khô sau 3 ngày. + Phủ 0.1 ml dịch E.coli ở nồng độ 108 Cfu/ml lên bề mặt thạch.
+ Cắt mẫu trên màng lọc có phủ nano bạc và màng lọc đối chứng đường kính 2 cm, vị trí cắt ở giữa của màng lọc.
+ Đặt mẫu lọc tinh có tẩm nano và không tẩm nano vào giữa đĩa thạch đã chuẩn bị sẵn, dùng một miếng xốp ép miếng bông bám sát lên bề mặt. Đặt vào tủ nuôi cấy, ủ trong thời gian 24h ở nhiệt độ 37oC.
+ Sau 24h đưa ra quan sát vòng tròn kháng khuẩn xuất hiện xung quanh (nếu có) các mẫu đối chứng và mẫu tẩm nano bạc trên đĩa thạch, chụp kết quả.
b) Xác định khả năng kháng khuẩn của màng lọc tẩm nano bạc * Các bước tiến hành:
Trong nghiên cứu này, khả năng kháng khuẩn của màng lọc tẩm nano bạc được xác định dựa vào phương pháp đếm khuẩn lạc. Quy trình tiến hành phân tích được tiến hành như sau:
- Màng màng phủ nano bạc và màng màng không phủ nano bạc (mẫu đối chứng) được cắt theo kích thước 2x2 cm;
- Ngâm màng màng đối chứng (không tẩm nano bạc) và màng tẩm nano bạc
33
- Sau thời gian 24 giờ hút 0,1 ml dịch vi khuẩn E.coli từ các đĩa chứa các loại
vật liệu mang đi phân tích vi sinh. Mẫu được ủ trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ 37°C.
- Đếm số khuẩn lạc xuất hiện ở mỗi đĩa bằng mắt thường và tính mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu.
* Xác định mật độ vi khuẩn: Đếm tất cả số các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa
sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25-250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn trong 1ml mẫu được tính như sau :
( / ) =
+ ⋯ +
Trong đó : N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn;
ni :số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i;
V : thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa; fi : độ pha loãng tương ứng.
2.3.2.2 Khả năng kháng khuẩn của màng lọc khi tiếp xúc với không khí
Trong môi trường không khí có rất nhiều loại VSV có hại cho sức khỏe con người nhưng phổ biết nhất là tổng VKHK và nấm và việc đánh giá 2 loài VSV này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp. Do đó đánh giá khả năng kháng vi khuẩn và nấm có mặt trong không khí của màng lọc phủ nano bạc. Để thực hiện việc đánh giá, tiến hành lắp màng lọc vào 1 thiết bị hình hộp chữ nhật có gắn quạt để hút không khí bên ngoài đập vào bề mặt màng lọc. Sau 1 thời gian chạy, màng lọc giữ lại các vi khuẩn trên bề mặt và việc xác định mật độ vi khuẩn còn lại trên màng lọc phủ nano bạc so sánh với mật độ vi khuẩn tích tụ trên bề mặt màng lọc không phủ nano bạc (mẫu đối chứng) cho biết khả năng kháng khuẩn của màng lọc nano bạc.
* Vật liệu và thiết bị:
-Màng lọc thô Camfil Farr G4, màng lọc tinh Camfil Farr F6 phủ nano bạc, và màng lọc tinh Camfil Farr F6 không phủ nano bạc.
-Môi trường thạch PCA – môi trường đặc trưng để phân lập tổng VKHK, môi trường Sabouraud để phân lập nấm.
34
- Thiết bị chạy thử nghiệm được sử dụng có cấu tạo như trên hình 2.4: ống PVC hình hộp chữ, rỗng hai đầu, kích thước cửa sổ: 180×260 cm; 2 quạt hút mắc nối tiếp. Đầu không khí đi vào để lắp các màng lọc. Bộ lọc sử dụng để lắp vào thiết bị gồm 2 lớp lọc, lớp bên ngoài là lọc thô, lớp bên trong là lớp lọc tinh. Kích thước của lớp lọc 28,3 cm ×18,5 cm.
- Thiết bị đo tốc độ gió DIGITAL ANEMOMETER (Model: AM-4203). - Tủ cấy vô trùng (Đài Loan), tủ nuôi ủ vi sinh FFC 90E VELP, nồi hấp tiệt trùng 25X-2 (Mỹ), tủ sấy Memmert (Đức), cân phân tích DJ-300TW (Nhật), máy lắc Votex VX-100 Labnet (Mỹ).
- Đĩa petri đường kính 9cm, pipet, kéo, đèn cồn, bông không thấm…
* Các bước tiến hành:
- Lắp màng lọc : lắp bộ lọc gồm 2 lớp lọc, lớp lọc thô lắp bên ngoài sử dụng màng lọc thô màng lọc Camfil farr sợi tổng hợp G4. Lớp lọc tinh là vải lọc Camfil farr F6 chia làm 2 nửa, một nửa sử dụng vải lọc tinh không phủ nano (để đối chứng) và một nửa sử dụng vải lọc tinh phủ nano, hai nửa được dập cố định với nhau bằng các ghim nhỏ. Cố định các màng lọc vào thiết bị bằng đinh vít.
- Bật quạt để thiết bị làm việc liên tục trong 4 tuần để tích vi khuẩn lên các
màng lọc. Tốc độ gió duy trì ổn định ở mức v = 0,6 m/s.
- Sau 4 tuần dừng thiết bị, lấy các màng lọc ra, cắt mỗi màng lọc thành miếng nhỏ kích thước 3x3 cm. Sau thời gian chạy thử nghiệm, vi khuẩn và nấm trong không khí theo bụi bám trên các sợi lọc và sử dụng các màng lọc này như những nguồn cấy vi sinh lên các đĩa thạch.
35
Hình 2. 4. Thiết bị chạy thử nghiệm a) Đánh giá định tính khả năng kháng khuẩn
- Đặt mẫu lọc tinh có tẩm nano và không tẩm nano vào giữa đĩa thạch PCA đã chuẩn bị sẵn, dùng kéo nén xuống để miếng lọc tiếp xúc với mặt thạch. Đặt vào tủ nuôi cấy, ủ trong thời gian từ 24h đến 48h ở nhiệt độ 37oC.
+ Lần 1: Sau 24h đưa ra đánh giá trực quan mật độ vi khuẩn xuất hiện trên 2 đĩa thạch, chụp kết quả.
+ Lần 2: Sau 48h đưa ra đánh giá trực quan mật độ vi khuẩn xuất hiện trên 2 đĩa thạch, chụp kết quả.
b) Đánh giá định lượng khả năng kháng khuẩn
Quy trình thực hiện của thí nghiệm được đưa ra dựa trên quy trình đã sử dụng để đánh giá vi sinh có trong các mẫu thực phẩm và mỹ phẩm [6], nhằm đánh giá mối tương quan về lượng vi khuẩn, nấm tồn tại trên màng lọc tinh phủ nano bạc và màng lọc tinh không phủ nano bạc.
- Đong 10 ml nước muối sinh lý và nước RO vào 2 ống nghiệm;
- Cho dụng cụ thí nghiệm, môi trường nuôi cấy PCA, ống nghiệm chứa nước muối sinh lý và nước RO vào hấp khử trùng trong 1h.
36
- Cho mẫu vải lọc tẩm nano bạc vào 2 ống nghiệm; lắc ống nghiệm 10 lần, mỗi lần 5s bằng máy lắc Vortex, 1ml dịch chiết vi sinh cho vào nuôi cấy trong đĩa petri. Đặt vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC. Đọc kết quả sau 24h và 48h.
- Làm tương tự với mẫu vải lọc không tẩm nano bạc (mẫu đối chứng). - Cách đếm và xử lý kết quả: tương tự như mô tả trong mục 2.3.2 b).