Phương pháp phân tích và tổng hợp tài liệu là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các công trình nghiên cứu khoa học trong mọi lĩnh vực nghiên cứu. Sử dụng phương pháp này trong quá trình nghiên cứu chủ yếu đọc và tham khảo các tài liệu có liên quan đến vấn đề nghiên cứu phục vụ cho việc xây dựng cơ sở khoa học cho phần tổng quan (bao gồm về hiện trạng ô nhiễm không khí trong nhà, các công nghệ LSKK truyền thống và công nghệ LSKK bằng XTQ, việc điều chế và ứng dụng bạc trong các lĩnh vực nhất là trong khử trùng) từ đó lựa chọn phương pháp phủ nano bạc lên màng lọc và đánh giá hiệu quả làm việc, hiệu quả kháng khuẩn của bộ tiền lọc sử dụng màng lọc phủ nano bạc để giải quyết nhiệm vụ của đề tài cũng như giúp cho việc phân tích kết quả nghiên cứu và các vấn đề liên quan khác nhau.
27 2.3 Phương pháp thực nghiệm
2.3.1 Điều chế dung dịch nano bạc và phủ nano bạc lên màng lọc tinh 2.3.1.1 Điều chế dung dịch nano bạc 2.3.1.1 Điều chế dung dịch nano bạc
Dung dịch nano bạc tiến hành điều chế bằng phương pháp hóa học dung dịch nước. Cơ sở lý thuyết của phương pháp là sử dụng chất khử mạnh NaBH4 để khử ion Ag+ thành bạc nguyên tử, sau khi hình thành các nguyên tử bạc có xu hướng kết khối với nhau và phát triển thành các hạt bạc có kích thước lớn dần. Để giới hạn kích thước của các hạt bạc được hình thành, phương pháp sử dụng chitosan như một chất bao bọc, hạn chế sự tiếp xúc và phát triển kích thước của các hạt bạc, mục đích duy trì kích thước hạt ở dưới 100nm.
* Phương trình phản ứng:
Ag+ + BH4- + H2O Ag + B(OH)4
* Dụng cụ và hóa chất:
+ Hóa chất: - AgNO3 (Merck);
- Chitosan (Viện Hóa học- Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam; - NaBH4 (Merck);
- Nước cất.
+ Dụng cụ: - Máy khuấy cơ, ống đong, cốc thủy tinh 2L, cân điện tử, bình tam giác.
* Quy trình thực hiện:
Nano bạc được tổng hợp dựa theo quy trình của nhóm tác giả Ngô Quôcc Bưu và cs. ở Viện Công nghệ môi trường- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam [14], như mô tả trên quy trình hình 2.2 ,cụ thể :
-Dung dịch -chitozan 500ppm được điều chế bằng cách nghiền lượng cân chitozan dạng sợi trong cối sứ, hòa tan trong dung dịch 10% axit acetic, lọc rồi đưa về thể tích bằng nước cất và khuấy bằng máy khuấy ở tốc độ 1400 vòng/phút.
28
-Cân 1,58 g AgNO3, thêm vào 120 ml dung dịch -chitozan 500ppm, thêm 1830 ml nước cất và khuấy đều trong 30 phút được dung dịch đồng nhất ;
-Chuẩn bị dung dịch NaBH4 0,05M;
Hình 2. 2. Sơ đồ quy trình điều chế nano bạc Nhỏ từ từ từng giọt NaBH4 AgNO3 Dung dịch nano bạc Dung dịch đồng nhất (Tăng tốc độ khuấy 1900 vòng/phút) Khuấy 30 phút Chitosan + H2O (acit acetic) Dung dịch phản ứng Khuấy 1400 vòng/phút Khuấy 30 phút
29
- Thêm 50 ml dung dịch NaBH4 0,5M vào hỗn hợp phản ứng một cách từ từ và tăng tốc độ khuấy lên 1900 vòng/phút. Khuấy trong 0,5h tiếp theo thu được dung dịch nano bạc.
* Khảo sát đặc tính của dung dịch nano bạc
Sau khi điều chế dung dịch nano bạc theo phương pháp hóa học dung dịch ướt, tiến hành phân tích đặc trưng vật lý và cấu trúc của dung dịch bằng các phương pháp và thiết bị sau:
- Phương pháp kính hiển vi truyền qua (Transmission Electron Microscope – TEM) được sử dụng để xác định kích thước và sự phân bố của các hạt nano bạc.
Thiết bị có độ phóng đại rất lớn có thể từ vài chục đến vài trăm nghìn lần với nhiều vật liệu và với các nguyên tử nó có thể đạt được độ phóng đại tới 15 triệu lần. Nhờ cách tạo ảnh nhiễu xạ, vi nhiễu xạ và nano nhiễu xạ, kính hiển vi điện tử truyền qua còn cho biết nhiều thông tin chính xác về cách sắp xếp các nguyên tử trong mẫu, chi tiết đến từng hạt, từng diện tích cỡ µm2 và nhỏ hơn.
Các mẫu được đo trên máy JEM1010 (JEOL – Nhật Bản) của Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, có hệ số phóng đại M = x50 – x600.000, độ phân giải δ = 3 A°, điện áp gia tốc U = 40 –100 kV.
- Phương pháp hấp thụ phân tử UV-VIS:đây là phương pháp dựa trên sự so
sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định, được sử dụng để xác định xác định sự có mặt của nguyên tử bạc hóa trị 0.
Các mẫu được phân tích trên máy JASCO-V670 của khoa Hóa trường Đại học Sư phạm.
2.3.1.2 Nghiên cứu chế tạo bộ tiền lọc phủ nano bạc a) Quy trình tẩm nano bạc lên bộ lọc
Bộ tiền lọc của thiết bị LSKK bằng XTQ thực chất gồm 2 lớp lọc là lọc thô và lọc tinh. Cả 2 lớp lọc đều được làm bằng các loại vải sợi tổng hợp, nhưng do có kích thước sợi và khoảng cách giữa các sợi khác nhau mà có khả năng loại bỏ bụi
30
khác nhau: lớp lọc thô loại bỏ các hạt bụi có kích thước trên 3 µm còn lớp lọc tinh có thể loại bỏ các hạt bụi lớn hơn 1 µm, thậm chí đến 0.5 µm tùy cấp độ của bộ lọc. Thí nghiệm lựa chọn màng lọc tinh để phủ nano bạc.
Các loại màng lọc không khí được phủ nano bạc bằng phương pháp nhúng thay vì phải sử dụng các phương pháp phun phủ vật lý phức tạp và tốn kém hơn. Với phương pháp này, các phần tử nano bạc bám vào các sợi lọc và được giữ lại bởi lực hút tĩnh điện và lực Van de van (Hình 2.3). Điều kiện cần thiết của màng lọc không khí dùng để tẩm nano bạc là phải thấm hút tốt để dễ dàng thấm nano bạc. Đồng thời màng phải có bề mặt bông xốp để không khí dễ dàng đi qua màng nhưng vẫn giữ được bụi và vi khuẩn trong không khí tốt nhất.
* Hóa chất và dụng cụ
+ Hóa chất: - Dung dịch nano bạc 500 ppm điều chế được ở trên; - Màng lọc tinh F6 bằng sợi tổng hợp của Camfil Farr. + Dụng cụ: - Cốc thủy tinh 2L, kẹp.
* Các bước tiến hành
Dung dịch nano bạc 500 ppm (kích thước hạt trung bình 20 - 25 nm) ngay sau khi tổng hợp thành công được sử dụng để phủ lên màng lọc không khí. Phương pháp tẩm nano bạc lên màng lọc không khí được tiến hành như sau: cho màng lọc tinh kích thước 50×60 cm vào cốc thủy tinh 2L, cho dung dịch nano bạc 500 ppm vào cốc sao cho ngập màng lọc. Ngâm màng lọc với dung dịch nano bạc trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để màng được thấm đều nano bạc. Sau 2 giờ, lấy các mẫu màng này ra để khô tự nhiên trong 24 giờ. Thể tích dung dịch nano bạc ban đầu cho vào ngâm là 800ml, thể tích dung dịch nano bạc sau khi lấy màng vải lọc ra là 680ml.
31
Cuối cùng màng được được gấp và bảo quản trong túi tối màu trước khi đưa ra sử dụng. Phương pháp đánh giá định lượng bạc: nhúng tấm lọc đã phủ bạc vào dung dịch HNO3 làm tan bạc, sau đó đem phân tích hàm lượng rồi quy đổi ra trên diện tích tấm lọc.
b) Đặc trưng cấu trúc của nano bạc trên màng lọc tẩm nano bạc
Phương pháp kính hiển vi quét (Scanning Electron Microscope - SEM): được
sử dụng để xác định hình thái bề mặt của vật liệu. Ảnh được phóng đại theo phương pháp này thì mẫu không cần phải cắt lát mỏng và phẳng, cho phép quan sát được mẫu kể cả khi bề mặt mấp mô. Độ phóng đại của kính hiển vi điện tử quét thông thường từ vài chục đến vài trăm ngàn lần, năng suất phân giải là 5nm đối với bề mặt bằng cách thu điện tử thứ cấp, do đó cho ta thấy được các chi tiết thô trong công nghệ nano.
Các mẫu được đo trên máy JSM 5410- Nhật Bản của Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương.
2.3.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các màng lọc tẩm nano bạc
2.3.2.1 Màng lọc tẩm nano bạc tiếp xúc trực tiếp với dịch vi khuẩn
Màng lọc ngay sau khi tẩm nano bạc được cho tiếp xúc với dịch vi khuẩn
E.Coli để đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng lọc. Xác định một cách định
tính khả năng kháng khuẩn của màng lọc phủ nano bạc bằng cách quan sát vòng kháng khuẩn xung quanh các màng lọc phủ nano bạc và đối chứng khi đặt các màng
lọc này tiếp xúc với môi trường chứa E.Coli. Sau đó định lượng khả năng kháng khuẩn của các màng lọc này bằng cách xác định % lượng vi khuẩn E.Coli bị tiêu
diệt sau khi tiếp xúc với màng lọc tẩm nano bạc, có so sánh với mẫu đối chứng (mẫu không phủ nano bạc).
* Hóa chất và dụng cụ:
+ Hóa chất: - Môi trường Chromocult – môi trường đặc trưng để phân lập
32
- Màng lọc tinh phủ và không phủ nano bạc.
+ Dụng cụ: - Đĩa petri đường kính 9cm, pipet, kéo, đèn cồn, bông không thấm…,
- Tủ cấy vô trùng (Đài Loan), tủ nuôi ủ vi sinh FFC 90E VELP, nồi hấp tiệt trùng 25X-2 (Mỹ), tủ sấy Memmert (Đức), cân phân tích DJ-300TW (Nhật), máy lắc Votex VX-100 Labnet (Mỹ).
a) Quan sát vòng kháng khuẩn của màng lọc tẩm nano bạc Phương pháp tiến hành:
+ Pha chế môi trường E.Coli, khử trùng và làm nguội đến 50°C, đổ ra đĩa petri
trong điều kiện vô trùng (tủ cấy), mỗi đĩa khoảng 12 - 15 ml, để khô sau 3 ngày. + Phủ 0.1 ml dịch E.coli ở nồng độ 108 Cfu/ml lên bề mặt thạch.
+ Cắt mẫu trên màng lọc có phủ nano bạc và màng lọc đối chứng đường kính 2 cm, vị trí cắt ở giữa của màng lọc.
+ Đặt mẫu lọc tinh có tẩm nano và không tẩm nano vào giữa đĩa thạch đã chuẩn bị sẵn, dùng một miếng xốp ép miếng bông bám sát lên bề mặt. Đặt vào tủ nuôi cấy, ủ trong thời gian 24h ở nhiệt độ 37oC.
+ Sau 24h đưa ra quan sát vòng tròn kháng khuẩn xuất hiện xung quanh (nếu có) các mẫu đối chứng và mẫu tẩm nano bạc trên đĩa thạch, chụp kết quả.
b) Xác định khả năng kháng khuẩn của màng lọc tẩm nano bạc * Các bước tiến hành:
Trong nghiên cứu này, khả năng kháng khuẩn của màng lọc tẩm nano bạc được xác định dựa vào phương pháp đếm khuẩn lạc. Quy trình tiến hành phân tích được tiến hành như sau:
- Màng màng phủ nano bạc và màng màng không phủ nano bạc (mẫu đối chứng) được cắt theo kích thước 2x2 cm;
- Ngâm màng màng đối chứng (không tẩm nano bạc) và màng tẩm nano bạc
33
- Sau thời gian 24 giờ hút 0,1 ml dịch vi khuẩn E.coli từ các đĩa chứa các loại
vật liệu mang đi phân tích vi sinh. Mẫu được ủ trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ 37°C.
- Đếm số khuẩn lạc xuất hiện ở mỗi đĩa bằng mắt thường và tính mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu.
* Xác định mật độ vi khuẩn: Đếm tất cả số các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa
sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25-250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn trong 1ml mẫu được tính như sau :
( / ) =
+ ⋯ +
Trong đó : N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn;
ni :số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i;
V : thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa; fi : độ pha loãng tương ứng.
2.3.2.2 Khả năng kháng khuẩn của màng lọc khi tiếp xúc với không khí
Trong môi trường không khí có rất nhiều loại VSV có hại cho sức khỏe con người nhưng phổ biết nhất là tổng VKHK và nấm và việc đánh giá 2 loài VSV này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp. Do đó đánh giá khả năng kháng vi khuẩn và nấm có mặt trong không khí của màng lọc phủ nano bạc. Để thực hiện việc đánh giá, tiến hành lắp màng lọc vào 1 thiết bị hình hộp chữ nhật có gắn quạt để hút không khí bên ngoài đập vào bề mặt màng lọc. Sau 1 thời gian chạy, màng lọc giữ lại các vi khuẩn trên bề mặt và việc xác định mật độ vi khuẩn còn lại trên màng lọc phủ nano bạc so sánh với mật độ vi khuẩn tích tụ trên bề mặt màng lọc không phủ nano bạc (mẫu đối chứng) cho biết khả năng kháng khuẩn của màng lọc nano bạc.
* Vật liệu và thiết bị:
-Màng lọc thô Camfil Farr G4, màng lọc tinh Camfil Farr F6 phủ nano bạc, và màng lọc tinh Camfil Farr F6 không phủ nano bạc.
-Môi trường thạch PCA – môi trường đặc trưng để phân lập tổng VKHK, môi trường Sabouraud để phân lập nấm.
34
- Thiết bị chạy thử nghiệm được sử dụng có cấu tạo như trên hình 2.4: ống PVC hình hộp chữ, rỗng hai đầu, kích thước cửa sổ: 180×260 cm; 2 quạt hút mắc nối tiếp. Đầu không khí đi vào để lắp các màng lọc. Bộ lọc sử dụng để lắp vào thiết bị gồm 2 lớp lọc, lớp bên ngoài là lọc thô, lớp bên trong là lớp lọc tinh. Kích thước của lớp lọc 28,3 cm ×18,5 cm.
- Thiết bị đo tốc độ gió DIGITAL ANEMOMETER (Model: AM-4203). - Tủ cấy vô trùng (Đài Loan), tủ nuôi ủ vi sinh FFC 90E VELP, nồi hấp tiệt trùng 25X-2 (Mỹ), tủ sấy Memmert (Đức), cân phân tích DJ-300TW (Nhật), máy lắc Votex VX-100 Labnet (Mỹ).
- Đĩa petri đường kính 9cm, pipet, kéo, đèn cồn, bông không thấm…
* Các bước tiến hành:
- Lắp màng lọc : lắp bộ lọc gồm 2 lớp lọc, lớp lọc thô lắp bên ngoài sử dụng màng lọc thô màng lọc Camfil farr sợi tổng hợp G4. Lớp lọc tinh là vải lọc Camfil farr F6 chia làm 2 nửa, một nửa sử dụng vải lọc tinh không phủ nano (để đối chứng) và một nửa sử dụng vải lọc tinh phủ nano, hai nửa được dập cố định với nhau bằng các ghim nhỏ. Cố định các màng lọc vào thiết bị bằng đinh vít.
- Bật quạt để thiết bị làm việc liên tục trong 4 tuần để tích vi khuẩn lên các
màng lọc. Tốc độ gió duy trì ổn định ở mức v = 0,6 m/s.
- Sau 4 tuần dừng thiết bị, lấy các màng lọc ra, cắt mỗi màng lọc thành miếng nhỏ kích thước 3x3 cm. Sau thời gian chạy thử nghiệm, vi khuẩn và nấm trong không khí theo bụi bám trên các sợi lọc và sử dụng các màng lọc này như những nguồn cấy vi sinh lên các đĩa thạch.
35
Hình 2. 4. Thiết bị chạy thử nghiệm a) Đánh giá định tính khả năng kháng khuẩn
- Đặt mẫu lọc tinh có tẩm nano và không tẩm nano vào giữa đĩa thạch PCA đã chuẩn bị sẵn, dùng kéo nén xuống để miếng lọc tiếp xúc với mặt thạch. Đặt vào tủ nuôi cấy, ủ trong thời gian từ 24h đến 48h ở nhiệt độ 37oC.
+ Lần 1: Sau 24h đưa ra đánh giá trực quan mật độ vi khuẩn xuất hiện trên 2 đĩa thạch, chụp kết quả.
+ Lần 2: Sau 48h đưa ra đánh giá trực quan mật độ vi khuẩn xuất hiện trên 2 đĩa thạch, chụp kết quả.
b) Đánh giá định lượng khả năng kháng khuẩn
Quy trình thực hiện của thí nghiệm được đưa ra dựa trên quy trình đã sử dụng để đánh giá vi sinh có trong các mẫu thực phẩm và mỹ phẩm [6], nhằm đánh giá mối tương quan về lượng vi khuẩn, nấm tồn tại trên màng lọc tinh phủ nano bạc và màng lọc tinh không phủ nano bạc.
- Đong 10 ml nước muối sinh lý và nước RO vào 2 ống nghiệm;
- Cho dụng cụ thí nghiệm, môi trường nuôi cấy PCA, ống nghiệm chứa nước muối sinh lý và nước RO vào hấp khử trùng trong 1h.
36
- Cho mẫu vải lọc tẩm nano bạc vào 2 ống nghiệm; lắc ống nghiệm 10 lần,