trong sữa tiệt trùng
1. Quy trình đã được xây dựng
Từ tài liệu tham khảo, em nhận thấy những người đi trước đã nghiên cứu và đưa ra quy trình phát hiện nhanh E.coli và Bacillus nhiễm tạp trong sữa tươi tiệt trùng như sau [4]:
• Ở mật độ nhiễm chủ động 1 CFU/1ml
Ly tâm 10000 vòng/phút, 10 phút
Ly tâm 100vòng/phút, 5 phút
Để vào tủ lạnh -20 oC trong 15 phút
Lấy ra, phá vỡ tế bào trên máy lắc gia nhiệt 96 oC trong 15 phút, 5 phút voltex 1 lần
Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút
Thu dịch nổi cho phản ứng PCR
1ml TE Thu cặn tế bào
Thu cặn tế bào
200ml H2O Lấy 1ml cho vào ống eppendoft
Lấy 200ml sữa 20ml EDTA 0,25M Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút 10ml đệm phosphat pH 7,2 Ly tâm 10000 vòng/phút, 5phút 30ml TSBYE Tăng sinh 5h ở 37 độ, lắc 200 vòng/phút Ly tâm 10000 vòng/phút, 10 phút 1ml TE Thu cặn tế bào Thu cặn tế bào Thu cặn tế bào
Hình 5. Quy trình phát hiện Bacillus và E.coli trên sữa tiệt trùng không đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/1ml
• Ở mật độ nhiễm chủ động 1 CFU/25ml
Ly tâm 10000vòng/phút, 5 phút
Để vào tủ lạnh -20 oC trong 15 phút
Lấy ra, phá vỡ tế bào trên máy lắc gia nhiệt 96 oC trong 15 phút, 5 phút voltex 1 lần
Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút
Thu dịch nổi cho phản ứng PCR
Thu cặn tế bào
200ml H2O
Hình 6. Quy trình phát hiện Bacillus trên sữa tiệt trùng không đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/25ml
2. Hạn chế của quy trình
Đề tài trên đã đưa ra hai quy trình phát hiện Bacillus và E.coli [4]. Đối với quy trình phát hiện ở mật độ nhiễm chủ động 1 CFU/1ml (Hình 5) đã thành công với cả Bacillus và E.coli. Độ nhạy của quy trình là 1CFU/1ml, thời gian tăng sinh cho phản ứng PCR dương tính là 4 giờ với Bacillus và 3
giờ với E.coli. Độ nhạy của quy trình này thấp (1CFU/1ml ), đối với một số tiêu chuẩn thì độ nhạy này yêu cầu cao hơn nữa.
Đối với quy trình phát hiện ở mật độ nhiễm chủ động 1 CFU/25ml (Hình 6) mới chỉ thành công với cả Bacillus mà chưa đưa ra được kết quả với
E.coli. Độ nhạy của quy trình là 1CFU/25ml, thời gian tăng sinh cho phản ứng PCR dương tính là 5 giờ. Quy trình này tồn tại nhữung hạn chế sau:
• Quy trình tiến hành cồng kềnh, phức tạp qua nhiều bước, thời gian tăng sinh cho phản ứng PCR dài.
• Quy trình thực hiện với một lượng mẫu lớn (200ml) nên rất khó khăn và phức tạp trong quá trình ly tâm và tách chiết DNA. Mất nhiều thời gian và dễ bị nhiễm.
• Không thể tiến hành phân tích đồng thời cả hai vi sinh vật E.coli và Bacillus trong một phản ứng PCR.
• Cần phải chạy điện di và việc phân biệt kết quả dựa vào độ lớn của vạch thu được sau điện di.
• Các bước tiến hành chưa được tối ưu.
3. Đề xuất phương án nghiên cứu hoàn thiện quy trình
Với mục tiêu của đề tài là hoàn thiện quy trình phát hiện E.coli và Bacillus nhiễm tạp trong sữa tiệt trùng và khắc phục những hạn chế của quy trình trên, em xin đề xuất phương phán nghiên cứu hoàn thiện quy trình như sau:
•Lựa chọn thời gian ly tâm thu sinh khối tế bào vi sinh vật nhằm mục đích thu đuợc tối đa lượng tế bào vi sinh vật sống trong cặn tế bào trong quá trình ly tâm.
•Lựa chọn một môi trường tăng sinh thích hợp nhất để tăng sinh cả E.coli
và Bacillus nhằm giảm tối đa thời gian tăng sinh cho cho quy trình
•Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp cho vi sinh vật để cho kết quả dương tính
•Ứng dụng kỹ thuật Real time PCR để phát hiện nhanh các vi sinh vật
B.cereus và E.Coli nhằm tăng độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng và giảm thời gian cho quy trình
•Đề xuất một quy trình phát hiện nhanh E.coli và Bacillus đơn giản hơn, hiệu quả hơn và nhanh chóng hơn.