7.1. Nguyên tắc:
Kỹ thuật Real Time PCR cho phép hiển thị và theo dõi trực tiếp quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang. Dựa vào cường độ phát huỳnh quang mà có thể định lượng được các đoạn DNA hình thành. Có 3 kỹ thuật được sử dụng cho real time PCR: SYBR Green, TaqMan (phương pháp 5’ nuclease), đầu dò lai. Trong đó phương pháp nhuộm màu SYBR Green là phương pháp đơn giản và kinh tế hơn cả cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm PCR trong phản ứng Real time. SYBR Green gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA mạch kép. Do vậy, khi sản phẩm PCR được tích lũy, cường độ phát huỳnh quang sẽ tăng lên .
- Ưu điểm của phương pháp SYBR Green: rẻ tiền, dễ sử dụng, nhạy. - Nhược điểm: do SYBR Green liên kết với bất kỳ một DNA mạch kép nào trong phản ứng, bao gồm cả primer- dimers và những sản phẩm không đặc hiệu khác, dẫn tới kết quả cao hơn so với nồng độ đích.
Trong đề tài này em tiến hành phát hiện đồng thời sự có mặt của E.coli và
Bacillus nhiễm tạp trong sữa tiệt trùng vì vậy sử dụng tác nhân gắn lên DNA SBYR Green. Chất nhuộm mầu này được gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA kép, khi được gắn với sợi DAN kép thì cường độ phát huỳnh quang tăng lên, khi bản sao tạo ra càng nhiều thì tín hiệu phát ra của chất mầu sẽ tăng lên theo tỉ lệ thuận..
7.2. Tiến hành:
• Lựa chọn các cặp mồi.
Các cặp mồi được sử dụng ở đây được lựa chọn dựa trên nguyên tắc đã được thiết kế và nghiên cứu tính đặc hiệu, tính bao trùm với kết quả tương đối có thể chấp nhận được từ các tác giả đi trước trong lĩnh vực này
Thực hiện phản ứng Real- time PCR với các thành phần cho một phản ứng là 50µl như sau: - Buffer: 5µl - Mg2+ : 5µl - dNTP : 2µl - Primer: 0.5µl - Taq : 3µl (5U/µl) -DNA: 5µl - DMSO/SYBR Green: 2.5µl - H2O cho tới 50µl 7.3 Đánh giá kết quả
Hình 4. Đồ thị chuẩn hóa của phản ứng Real-time PCR
Cp: Cross point: Là số liệu thống kê sự gia tăng đáng kể của ∆R được phát hiện đầu tiên. Cp càng nhỏ thì gen biểu hiện càng mạnh.
∆R: hiệu số so sánh giữa kết quả phản ứng PCR có mẫu với kết quả phản ứng PCR không mẫu hoặc trong những chu kỳ đầu tiên dựa trên cường độ phát huỳnh quang của SYBR Green [5].
∆Cp: là chỉ số hiệu chỉnh chuẩn hóa
Chọn mẫu có Cp của nhỏ nhất làm chuẩn, từ đó tính độ lệch theo chuẩn đối với các mẫu sẽ suy ra ∆Cp của từng mẫu. Tính toán Cp của các gen sau phải trừ đi độ lệch chuẩn.