2.2.1 Quy trình lên men rượu vang
Sy rô nho được pha với tỷ lệ 20%, sau đó bổ sung đường kính để đạt nồng độ chất khô 250 Bx. Lên men bằng chủng nấm men S.cerevisiae SH09. Kết thúc quá
trình này, tiếp tục lên men dịch trong vòng 10 ngày ở nhiệt độ 25°C, thu được rượu vang non. Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106
tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic.
Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106 tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic.
Mẫu ĐC: Lên men malolactic tự phát
Mẫu F: Lên men Malolactic, cấy vi khuẩn lactic ngay đầu quá trình lên men rượu. Mầu M: Lên men malolactic, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu được 48h.
Mẫu E: Lên men malolactic, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu vừa kết thúc.
2.2.2 Phương pháp vi sinh vật
- Phương pháp phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả, lá nho
Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho
- Phương pháp xác định khả năng lên men của chủng vi khuẩn malolactic
Lấy một đầu que cấy giống vi khuẩn malolactic từ khuân lạc trên đĩa petri hoặc ống thạch nghiêng rồi cấy vào 10-50 ml môi trường lên men malolactic dịch vang non sau khi lên men rượu của bộ môn thực phẩm và dinh dưỡng Viện Công nghiệp Thực phẩm cung cấp và lọc vô trùng bằng màng 0,45 micromet. Lên men ở nhiệt độ
250C. Lấy mẫu hàng ngày để kiểm tra hàm lượng axít malic bị tiêu thụ hoặc hàm lượng axít lactic tạo thành.
- Phương pháp xác định hình thái, kích thước tế bào và nảy chồi của các chủng vi khuẩn malolactic trên kính hiển vi.
- Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu đánh them phương pháp[1].
- Phương pháp xác định tế bào Gram + theo Collin, 1989[15].
Phương pháp xác định vi khuẩn kỵ khí bằng khả năng tạo khuẩn lạc trên đĩa thạch MRS trong bình đã loại bỏ oxy[43].
- Phương pháp xác định vi khuẩn hiếu khí bằng khả năng sinh hoạt tính catalaza trên môi trường thạch MRS[43].
- Phương pháp xác định khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn malolactic: Môi trường thạch MRS có bổ sung 20g/l CaCO3 được đổ vào các đĩa pettri.
Tiến hành đục lỗ trên các đĩa thạch với số lượng 3 lỗ/đĩa. Sau đó hút 30µl dịch vi khuẩn malolactic cho vào mỗi lỗ. Ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ 37oC trong 3-5 ngày và quan sát vòng phân giải CaCO3 của vi khuẩn.
- Phương pháp xác định đặc tính lên men dị hình (khả năng sinh CO2) bằng ống Dulham theo Collin, 1989 [15].
Trong môi trường lên men MRS có chứa glucoza trong ống nghiệm 10ml có chứa ống Dulham ở dưới đáy của ống nghiệm được cấy giống vi khuẩn lactic. Chủng nào sinh khí CO2 sau 24 - 48h sẽ tạo ra áp xuất đẩy ống thử dulham lên phía
trên bề mặt môi trường trong ống nghiệm. Qua đó xác định được các chủng lên men di hình. Chủng nào không sinh khí sẽ không đẩy được ống thử Dulham lên phía trên bề mặt môi trường trong ống nghiệm.
2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa
- Phương pháp đo pH
30 ml mẫu được được lấy ra cho vào cốc mẫu. Giá trị pH được xác định trực tiếp bằng pH metter (Máy đo pH 315i/SET, Đức).
Độ đục của mẫu được xác định bằng máy đo độ đục Turbidity (Italy).
- Phương pháp đo tỷ trọng: Tỷ trọng của dung dịch được xác định bằng thước đo tỷ trọng ở 200C.
- Xác định axít bay hơi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Axít bay hơi được xác định bằng phương pháp của Zoecklein và cs (1989) [48]. 10 ml mẫu được cho vào bình Sellier. Sau khi cất, 100ml dung dịch chưng cất được chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N.
Axít bay hơi được tính theo công thức sau đây:
Axít bay hơi (g axít axetic/l) = [ml NaOH x N x 0,06)/V] x 100 Trong đó: N: nồng độ của NaOH , V: thể tích mẫu (ml).
- Phương pháp phân tích axít tổng số.
Axít tổng số được xác định theo phương pháp của Zoecklein (1989). 10 mL mẫu được đun sôi trong 30 giây để loại bỏ C02. Sau đó 90 ml nước cất được thêm vào và sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N.
Axít tổng số được tính theo công thức sau:
Axít tổng số (g axít tactaric/L) =[(mL NaOH X N X 0,075)/V] X 1000 Trong đó: N: nồng độ NaOH, V: thể tích mẫu (mL).
- Phương pháp phân tích etanol
Etanol được xác định bằng phương pháp cất trên thiết bị Distiller System (Đức), sau đó xác định độ cồn bằng alcohol metter.
- Xác định hàm lượng đường tổng số bằng phương pháp Graxianop [1]. - Phương pháp xác định đường sót: theo Nelson Somogy (1952) [36]. - Phương pháp xác định hàm lượng axít L-malic:
Hàm lượng axit L-malic được đo bằng phương pháp kít chuẩn enzym (BOEHRINGER MANNHEIN, Cat.No.10139068035).
- Phương pháp xác định SO2 tự do và SO2 tổng số [20]. - Phương pháp xác định diaxetyl: theo AOAC (1995) [9].
- Phương pháp phân tích các chất thơm furfural, cis-lacton, trans-lacton và anillin: bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) [21].
- Xác định hàm lượng cồn theo TCVN 378:1986. Etanol được xác định bằng phương pháp cất trên thiết bị Distiller của Merck, sau đó xác định độ cồn bằng alcohol metter.
- Xác định hàm lượng axít L-malic, L-lactic và axít axetic bằng phương pháp kit chuẩn enzim (Boehringer Mánnhein, Đức).
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rƣợu vang
3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận
Các vi khuẩn có khả năng phân giải axít malic trong rượu vang được gọi là vi khuẩn malolactic. Để phân lập được các chủng malolactic này, trước hết phải tiến hành phân lập sơ bộ có định hướng (vi khuẩn gram dương, catalaza âm tính, khả năng phân giải CaCO3,...) để thu nhận được các chủng vi khuẩn lactic, rồi tiếp theo xác định khả năng lên men malolactic của các chủng nhằm tìm ra chủng có đặc tính công nghệ phù hợp nhất cho lên men malolactic rượu vang đỏ.
Phân lập sơ bộ các chủng vi khuẩn lactic và có định hướng lên men malolactic từ lá và quả nho tại Ninh Thuận, kết quả được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc Tên chủng Mầu sắc và hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào Phân giải CaCO3 Gram (+) NT1 Vàng nhạt, tròn, nhẵn, nhỏ Que ngắn, chuỗi 2, 3 tế bào + +
NT2 Trắng, tròn, xù xì, to Cầu nhỏ, chuỗi 2 tế bào + +
NT3 Trắng, tròn, gồ ghề, to Cầu, chuỗi 2 , 3 tế bào + +
NT4 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu nhỏ, chuỗi 2 tế bào + +
NT5 Trắng, tròn, gồ ghề, vừa Cầu to, chuỗi 2 tế bào + +
NT6 Trắng, tròn, nhẵn, to Que ngắn, chuỗi 2, 3 tế
Tên chủng Mâu săc và hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào Phân giải CaCO3 Gram (+) NT7 Vàng nhạt, tròn, xù xì, vừa Que dài, chuỗi 2 tế bào + +
NT8 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 3, 4 tế bào + +
NT9 Trắng nhạt, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2, 4 + +
NT10 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2,4 tế bào + + (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
NT11 Trắng sữa, nhẵn, to Cầu, chuỗi 2 tế bào + +
NT12 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2, 3 tế bào + +
NT13 Trắng , tròn, nhẵn, nhỏ Que dài, chuỗi 2 tế bào + +
NT14 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 3, 4 tế bào + +
NT15 Vàng, tròn, nhẵn, to Que ngắn, đơn bào + +
NT16 Vàng, tròn, xù xì, dẹt Que dẹt, đơn bào + +
NT17 Vàng, xù xì, nhỏ Que dẹt, chuỗi 2 tế bào + +
NT18 Trắng, xù xì, to Que ngắn, chuỗi 2 tế bào + +
NT19 Trắng, tròn, to Que, chuỗi 2, 4 tế bào + +
Kết quả bảng 3.1 cho thấy 20 chủng vi khuấn đều gram (+) và có vòng phân giải CaCO3 đã được phân lập. Trong đó, tương ứng với mỗi loại nguyên liệu là lá nho và quả nho. Các chủng này đều có hình thái khuấn lạc tròn, nhưng có bề mặt nhẵn hoặc xù xì, kích thước thay đổi từ nhỏ sang to và chủ yếu có mầu trắng. Hình dạng tế bào của các vi khuẩn này cũng thay đổi từ hình que đến hình cầu, có các tế bào đơn lẻ hoặc chuỗi đôi, chuỗi 3 và 4. Từ các đặc tính hình dạng bên ngoài trên, từ các chủng phân lập được này chúng tôi tiến hành các thí nghiệm xác định khả năng lên men malolactic trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2 Xác định khả năng lên men malolactic của các chủng vi khuẩn phân lập
Các chủng vi khuấn lactic phân lập được đã được thí nghiệm lên men trong bình dulham nhằm xác định khả năng sinh khí và kiểu hình lên men, hoặc được thí nghiệm dưới các điều kiện có hoặc không có ôxy để xác định đặc tính kỵ khí hoặc hiếu khí. Kết quả của các thí nghiệm này được trình bày ở bảng 3.2
Từ bảng 3.2 cho thấy:
Trong số 20 chủng vi khuấn lactic đã được phân lập: - Có 15 chủng sinh khí và 5 chủng không sinh khí.
- Có 15 chủng lên men dị hình và 5 chủng lên men đồng hình.
- Có 6 chủng lên men hiếu khí, 6 chủng lên men kỵ khí tùy tiện và 8 chủng lên men kỵ khí.
- Có 12 chủng không có khả năng lên men malolactic và 8 chủng có khả năng lên men malolactic.
- Cả 20 chủng đều là các chủng có hoạt tính catalaza âm tính.
Từ những nhận xét trên chúng tôi chọn 8 chủng là NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14, NT19 có khả năng lên men malolactic. Chúng đều là các chủng có hoạt tính catalaza âm tính, lên men dị hình, kỵ khí hoặc kỵ khí tuỳ tiện cho nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất của các chủng vi khuân lactic phân lập đƣợc Tên chủng Sinh khí Kiểu hình
lên men Kiểu hô hấp axít malic Phân giải Hoạt tính catalaza
NT1 + Dị hình Hiếu khí - - NT2 - Đồng hình Kỵ khí tùy tiện - - NT3 + Dị hình Kỵ khí + - NT4 + Dị hình Hiếu khí - - NT5 + Dị hình Hiếu khí - - NT6 + Dị hình Kỵ khí + - NT7 - Đồng hình Kỵ khí - - NT8 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT9 + Dị hình Kỵ khí + - NT10 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT11 - Đồng hình Kỵ khí - - NT12 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT13 - Đồng hình Kỵ khí - - NT14 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT15 + Dị hình Hiếu khí - - NT16 - Đồng hình Kỵ khí - - NT17 + Dị hình Hiếu khí - - NT18 + Dị hình Hiếu khí - - NT19 + Dị hình Kỵ khí + - NT20 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện - -
Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuấn có khả năng lên men malolactic cao.
Chúng tôi lấy 8 chủng đã chọn NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14, NT19 cho nuôi cấy trong môi trường nước nho axít (AG), nhiệt độ nuôi cấy là 25oC. Kết quả tuyển chọn các chủng vi khuấn có khả năng lên men malolactic cao trong môi trường nước nho axít (AG) được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Khả năng lên men malolactic của 8 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Chủng vi
khuấn
Hàm lƣợng axít malic (g/l) Hàm lƣợng axít lactic (g/l) Thời gian lên men
(ngày) Trƣớc lên men Sau lên men Trƣớc lên men Sau lên men
NT3 2,15 0,81 0,3 1,38 29 NT6 2,15 0,39 0,3 1,39 31 NT8 2,15 0,92 0,3 1,05 26 NT9 2,15 0,28 0,3 1,56 24 NT10 2,15 0,49 0,3 1,37 40 NT12 2,15 0,20 0,3 1,61 23 NT14 2,15 1,01 0,3 1,01 28 NT19 2,15 1,29 0,3 0,98 36 Ghi chú:
- Nhiệt độ quá trình lên men malolactic: 25oC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thời gian kết thúc lên men khi hàm lượng axít malic của dịch lên men không thay đổi đáng kể trong 3 ngày cuối cùng liên tiếp.
Kết quả ở bảng 3.3cho thấy: *Khả năng phân giải axít malic
- Chủng NT19 có khả năng phân giải axít malic thấp nhất với hàm lượng axít malic còn dư sau lên men là rất cao (1,29 g/l).
- Các chủng NT9 và NT12 có khả năng phân giải axít malic cao nhất với hàm lượng axít malic còn dư sau lên men rất thấp.
+ Chủng NT9 hàm lượng axít malic còn dư sau lên men là (0,28 g/l). + Chủng NT12 hàm lượng axít malic còn dư sau lên men là (0,20 g/l). *Khả năng tạo ra Axít lactic:
- Chủng NT19 có khả năng tạo ra Axít lactic thấp nhất với hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dịch sau lên men là rất thấp (0,98g/l).
- Các chủng NT9 và NT12 có khả năng tạo ra Axít lactic cao nhất với hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dich sau lên men rất cao.
+ Chủng NT9 hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dịch sau lên men là (1,56g/l). + Chủng NT12 hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dịch sau lên men là (1,61 g/l). *Thời gian lên men malolactic:
- Lâu nhất là chủng NT10 (40 ngày) - Chủng NT9 là (24 ngày)
- Ngắn nhất là chủng NT12 là (23 ngày)
Từ những nhận xét trên chúng tôi chọn chủng NT9 và NT12 vì có khả năng phân giải axít malic tốt nhất với hàm lượng axít malic còn dư trong dịch lên men thấp nhất chủng NT9 là 0,28 g/l, chủng NT12 là 0,20 g/l. Chủng NT9 và NT12 còn có khả năng lên men malolactic triệt để nhất trong thời gian ngắn từ 23 đến 24 ngày, được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3 Xác định khả năng chịu SO2 của 2 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được
Để đánh giá khả năng chịu SO2 và khả năng chịu etanol của các chủng malolactic phân lập được chúng tôi tiến hành lên men 2 chủng vi khuấn malolactic là NT9 và NT12 trên môi trường nước nho axít (AG) được sulphit hóa với hàm lượng K2S2O5 100 mg/l và bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v, nhiệt độ nuôi cấy là 25oC.
Khả năng phân giải axít malic thành axít lactic sau quá trình lên men malolactic được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4 Hàm lƣợng axít malic và axít lactic trƣớc và sau lên men Malolactic trên môi trƣờng nƣớc nho axít (AG) đƣợc sulphit hóa với hàm lƣợng K2S2O5. bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v
Chủng vi khuẩn malolactic
Axít malic (g/l) Axít lactic (g/l) Thời gian
lên men (ngày)
Trƣớc lên men Sau lên men Trƣớc lên men Sau lên men
NT9 2,15 1,45 0,3 0,8 30
NT12 2,15 0,14 0,3 1,68 25
Ghi chú: Nhiệt độ lên men 25oC trong thời gian từ 25 đến 30 ngày.
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy:
Khả năng phân giải axít malic
- Chủng NT9 hàm lượng axít malic còn dư trong dịch sau lên men là (1,45 g/l). - Chủng NT12 hàm lượng axít malic còn dư trong dịch sau lên men là (0,14 g/l).
Khả năng tạo ra Axít lactic
- Chủng NT9 hàm lượng Axít lactic được tạo thành trong dịch sau lên men là (0,8 g/l).
- Chủng NT12 hàm lượng Axít lactic được tạo thành trong dịch sau lên men là (1,68 g/l).
Thời gian lên men malolactic là
- Lâu nhất là Chủng NT9 (30 ngày) - Chủng NT12 là (25 ngày) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ những nhận xét trên chúng tôi nhận thấy Chủng NT9 không có khả năng chịu SO2 và etanol nên quá trình lên men malolactic diễn ra không hoàn toàn. Hàm lượng axít malic còn lại rất cao, là 1,45 g/l sau 30 ngày lên men. Còn chủng vi khuẩn còn lại là NT12 có khả năng phân giải malic rất tốt trong điều kiện môi trường được sulphit hóa, có nồng độ cồn cao, thể hiện ở hàm lượng malic còn lại sau lên men là không đáng kể là 0,14 g/l và có thời gian lên men nhanh là 25 ngày.
3.2 Nghiên cứu quá trình lên men malolactic của Chủng NT9 và Chủng NT12 trên môi trƣờng rƣợu vang non
Rượu vang non lên men từ dịch nho như 2.2.1 bởi chủng nấm men S. cervisiae SH09 (có thành phần etanol 12,8% v/v, đường sót 5,2 g/l, axít tổng số
5,39 g/l) được lên men malolactic bởi 2 chủng NT9, NT12 ở điều kiện nhiệt độ 25oC. Kết quả phân giải axít malic được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.1
Bảng 3.5 Hàm lƣợng axít malic trƣớc và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trƣờng rƣợu vang non