Do đặc điểm của khung tirucallan có chứa 7 nhóm methyl bậc 3 ở các vị trí: 18, 19, 26, 27, 28, 29, 30 và 1 nhóm methyl bậc hai ở vị trí 21 nên tín hiệu của các nhóm methyl bậc 3 xuất hiện ở dạng singlet và nhóm methyl ở vị trí 21 xuất hiện ở dạng doublet với hằng số ghép đôi trong khoảng 5,5 – 6,5 Hz phụ thuộc vào các nhóm chức ở các vị trí 22, 23.
Thường trong cấu trúc của các hợp chất tirucallan có liên kết đôi C7=C8 nên tín hiệu của proton ở C7 thường ở dạng doublet với hằng số ghép đôi khá nhỏ 3-4 Hz.
Bảng 1.1. Một số dữ liệu phổ 1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) của hợp chất 1-3 Vị trí H dạng pic 1 2 3 7 5,24 (1H, br s) 5,25 (d, J = 3,1 Hz) 5,23 (d, J = 3,2 Hz) 18 0,83 (3H, s) 0,79 s 0,79 s 19 0,72 (3H, s) 0,73 s 0,72 s 21 0,61 (3H, d, J = 6,6 Hz) 1,02 (d, J = 6,6 Hz) 0,84 (d, J = 5,9 Hz) 26 2,19 (3H, s) 1,22 s 1,30 s 27 1,95 (3H, s) 1,22 s 1,30 s 28 0,94 (3H, s) 0,95 s 0,94 s 29 0,83 (3H, s) 0,84 s 0,85 s 30 1,01 (3H, s) 0,97 s 0,94 s
Nhiều hợp chất tirucallan xuất hiện vòng 21,23-epoxy (vòng 5) dẫn đến độ chuyển dịch của các proton H20H23 có sự thay đổi, còn các tín hiệu khác ít thay đổi. Một dạng vòng 21,24-epoxy (vòng 6) khác cũng hay gặp trong quá trình phân lập các hợp chất tự nhiên, khi đó độ dịch chuyển hóa học của các proton H20H24
6 Bảng 1.2. Một số dữ liệu phổ 1H-NMR của hợp chất 4-6 Vị trí H (CDCl3, 400 MHz) H (CDCl3, 500 MHz) 4 5 6 7 5,27 br s 5,23 br s 5,15 (br d 3,0) 18 0,85 s 0,86 s 0,77 s 19 0,78 s 0,77 s 0,66 s 20 1,96 m 2,15 m 2,01 m 21 4,71 br s 4,76 (d, J = 3,3 Hz) 5,25 (d, J = 2,2 Hz) 22 1,88 m 1,49 m 2,35 (dd, J = 16,6, 12,7 Hz) 2,23 (dd, J = 16,6, 5,0 Hz) 23 4,43 m 4,19 m 24 3,18 br d (J = 7,9 Hz) 3,22 d (J = 5,4 Hz) 3,96 s 26 1,28 s 1,27 s 1,14 s 27 1,28 s 1,30 s 1,10 s 28 0,94 s 0,93 s 0,79 s 29 0,92 s 0,91 s 0,80 s 30 1,00 s 0,98 s 0,88 s
Độ chuyển dịch hóa học của các proton khác phụ thuộc rất lớn vào các nhóm chức gắn vào khung tirucallan cơ bản nên cần xác định rõ hơn khi sử dụng các kỹ thuật phổ 2D NMR.
1.4.2. Phổ 13C-NMR của các hợp chất tirucallan
Tương tự như phân tích các đặc trưng chính của khung tirucallan, phổ 13C- NMR xuất hiện các pic đặc trưng của 7 nhóm methyl bậc 3 ở các vị trí: 18, 19, 26, 27, 28, 29, 30 và 1 nhóm methyl bậc hai ở vị trí 21 với độ dịch chuyển hóa học khá ổn định nên có thể dựa vào độ chuyển dịch hóa học của chúng để có thể dự đoán sơ bộ khung tirucallan. Bên cạnh đó, do trong cấu trúc của các hợp chất tirucallan thường có liên kết đôi C7=C8 và ít có nhóm chức ở các cacbon lân cận nên C7
117,5÷118,5 và C8 145÷146 ppm. Trong nhiều dẫn xuất từ khung tirucallan thì nối đôi xuất hiện ở C8=C9 thay vì ở C7=C8 dẫn đến các độ dịch chuyển hóa học của các cacbon methyl thay đổi và độ chuyển dịch hóa học của hai cacbon C8, C9 ở trong vùng 133.2 – 134.5 ppm.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây xáo leo có tên khoa học là Paramignya scandens (Griff.) Craib [11] thuộc họ Cam quýt (Rutaceae).
Là dạng tiểu mộc leo; cành non có lông mịn, nâu; gai nhỏ cong, có lông. Lá có phiến bầu dục, vào 7x3,5 cm, đầu tà hay có đuôi ngắn, đáy tròn, gân-phụ 9-11 cặp; cuống 4-6 mm, có lông mịn. Hoa thường 1 ở nách lá, cọng 1 cm; lá dài nhỏ, rìa lông; cánh hoa dài 7 mm; tiểu nhụy 10, bằng nhau, chi có lông; noãn sào có lông. Trái không lông, xoan, dài đến 1,5 cm.
Dạng sống và sinh thái:Bụi leo, cành non có lông màu nâu [10].
Mẫu cây xáo leo - Paramignya scandens (Griff.) Craib, được thu thập tại Đà Lạt, Lâm Đồng trong tháng 5 năm 2013. Tên khoa học được TS. Nông Văn Duy giám định. Mẫu tiêu bản (số TN3/055) được lưu tại phòng mẫu của Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên.
Hình 2.1. Cây xáo leo - Paramignya scandens (Griff.) Craib
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai
bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4
10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp.
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 2.3.1. Phương pháp quang phổ tử ngoại (UV)
Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và vùng khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử, sự hấp thụ ấy gây ra chuyển dịch các điện tử từ orbital ở trạng thái cơ bản lên orbital có năng lượng cao hơn ở trạng thái kích thích. Chỉ có môt số dạng cấu trúc trong các hợp chất hữu cơ mới có sự hấp thụ ấy nên trên thực tế việc ứng dụng phổ tử ngoại giới hạn trong một số hợp chất có cấu trúc nối đôi liên hợp.
2.3.2. Phương pháp quang phổ hồng ngoại (IR)
Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng từ 10.000 đến 100 cm–1 và biến thành năng lượng của dao động phân tử. Sự hấp thu ấy có định lượng nhưng phổ hồng ngoại không biểu hiện thành đường thẳng mà là các dải hấp thụ với cường độ khác nhau, bởi vì sự biến đổi năng lượng dao động luôn đi kèm với sự biến đổi của năng lượng quay. Như vậy, phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ của 2 dạng năng lượng trong phân tử: năng lượng dao động và năng lượng quay. Dựa vào sự hấp thu này, có thể chia phổ hồng ngoại thành 3 vùng:
Vùng sóng ngắn (4000-1300 cm-1) gọi là vùng các nhóm chức vì các băng hấp thụ của các nhóm chức hữu cơ như OH, NH, CO... đều xuất hiện ở đây.
Vùng sóng dài (909-605 cm-1) đặc trưng cho các hấp thụ của dao động biến dạng của vòng thơm và các hấp thụ biến dạng của CH ngoài mặt phẳng.
Vùng sóng trung bình (1300-909 cm-1) được gọi là vùng chỉ vân tay vì nó được dùng để so sánh hình dạng các băng hấp thụ của các mẫu xem có đồng nhất hay không về phương diện hóa học.
Phương pháp phân tích này cho ta xác định các nhóm chức, vòng benzen có trong phân tử.
2.3.3. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Khi chúng ta đặt một chất có chứa nguyên tử 1H và 13C vào một từ trường rất mạnh và đồng thời chiếu xạ nó với một năng lượng điện từ, những hạt nhân của các nguyên tử đó có thể hấp thu năng lượng qua một quá trình gọi là cộng hưởng từ, sự hấp thụ này được lượng tử hóa và cho ra một phổ đặc trưng của hợp chất.
Trong phân tử, các hạt nhân hydro ở trong những vùng có mật độ điện tử khác nhau nên hấp thụ năng lượng ở từ trường có cường độ hơi khác nhau. Điều này dẫn đến các tín hiệu ứng với các proton đó sẽ xuất hiện ở những vị trí khác nhau trên phổ NMR. Ngoài ra còn có sự tương tác của từ trường của proton lân cận nhau gây ra sự chẻ tín hiệu, vì vậy khi quan sát tín hiệu có các trường hợp chùm đôi 1:1 (doublet), chùm ba 1:3:3:1 (triplet), chùm bốn (quartlet), ...
Với phổ 13C-NMR, mỗi carbon trong một phân tử hữu cơ bình thường chỉ cho một pic không có hiện tượng tương tác C-C làm chẻ tín hiệu thành nhiều pic.
Do vậy, khi nghiên cứu các kết quả phân tích của phổ này, cùng với các kỹ thuật DEPT, COSY, HETCOR, HMBC, HSQC chúng tôi có thể xác định được số lượng proton và carbon và vị trí của chúng trong phân tử.
2.3.4. Phương pháp khối phổ (MS)
Máy khối phổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lượng nhỏ chất thử, phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dương. Các mảnh ion này nhờ một bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cường độ khác nhau tương ứng với lượng khối
của mỗi ion, đó là khối phổ. Đa số ion phân tử (ion mẹ) bị phá rất nhanh từ 10-10
đến 10-3 giây để hình thành các mảnh ion mang điện dương, những ion này lại tiếp tục bị phá thành những ion nhỏ hơn. Chỉ có một số ít ion phân tử chưa kịp bị bắn phá di chuyển đến bộ phận tập hợp và thể hiện thành pic ion phân tử trên phổ, pic này sẽ cho ta biết khối lượng phân tử của chất thử.
Giá trị lớn của khối phổ là việc ứng dụng các mảnh ion tạo nên để phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Vì vậy, kết quả phân tích khối phổ cho chúng ta khối lượng phân tử của hợp chất và cấu trúc sơ bộ của chúng.
2.3.5. Thiết bị phân tích
Phổ tử ngoại được ghi trên máy Agilent 8453 tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ hồng ngoại được ghi bởi thiết bị JASCO FT-IR 4000 tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) với các kỹ thuật DEPT, COSY, HMBC, HSQC được ghi trên máy BRUKER Avante 500 với chất chuẩn nội TMS tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ khối được ghi trên máy Agilent 1260 series single quadrupole LC/MS tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy MicroQ-TOF III mass spectrometer tại Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc.
2.4. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào 2.4.1. Mục tiêu và cơ sở lý thuyết 2.4.1. Mục tiêu và cơ sở lý thuyết
Hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư và không ung thư in vitro của các mẫu chiết, cũng như để kiểm tra độc tính của thuốc với các dòng tế bào ung thư và không ung thư. Phép thử này dựa vào khả năng SRB bám vào protein của tế bào đã được cố định bởi axit trichloroaxetic (TCA). SRB là chất nhuộm aminoxanthene hồng nhạt với 2 nhóm sulfonic tác dụng gắn với các chất chứa amino acid cơ bản trong điều kiện axit nhẹ,
và tách ra trong điều kiện kiềm. Lượng chất màu tách ra từ tế bào được nhuộm là tương ứng với số lượng tế bào.
Độ mạnh của sự bám dính SRB cho phép phản ứng thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng. Phản ứng SRB được chứng minh là có tính ứng dụng bởi lớp tế bào sau khi cố định bởi TCA và nhuộm với SRB có thể được lưu giữ lâu dài. Chất mầu tách ra từ tế bào nhuộm SRB là bền vững. Với tính nhạy cao, sử dụng với phiến 96 giếng và tính bền vững, phản ứng SRB là phù hợp với ứng dụng sàng lọc lớn cũng như trong nghiên cứu.
2.4.2. Vật liệu
Các dòng tế bào
Các dòng tế bào sử dụng trong thực nghiệm hoạt tính sinh học được lưu giữ tại Phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Hai dòng tế bào đại diện để thử nghiệm hoạt tính của các mẫu chiết là:
Dòng RD: ung thư mô liên kết Dòng Hep- G2: ung thư gan
Môi trường nuôi tế bào
Môi trường nuôi các dòng tế bào ung thư:
- Môi trường MEME (Minineal Essential Medium with Eagle’s salts), 7-10% huyết thanh bê tươi và dịch kháng sinh PSF (potassium penicillin - streptomycin - fungizone), NAA (nonessential amino acid).
- Môi trường DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium), 10% huyết thanh bê tươi và dịch kháng sinh PSF, NAA.
- Dịch kháng sinh PSF: 100 đơn vị penixilin/ml, 100 g streptomyxin sunfat/ml, 0,25 g amphoterixin B/ml.
2.4.3. Phương pháp tiến hành
Nuôi tế bào ung thư in vitro theo Skehan và cs. Xác định hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhiwitayawuid và cs. đang được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI). Phương pháp này
đã được phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm 1996. Phép xác định gồm hai bước như sau:
Bước 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính
Chuẩn bị tế bào
- Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng MEME, Eagle hoặc DMEM.
- Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (CO2 5%; độ ẩm 98%; nhiệt độ 37oC, vô trùng tuyệt đối), tế bào được hoạt hoá trước khi thí nghiệm tiến hành từ 18-24 giờ.
- Dùng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa tế bào bằng đệm PBS. Pha tế bào bằng môi trường sạch, đếm số lượng, tạo huyền dịch tế bào ở nồng độ thí nghiệm (khoảng 3-5x104 tế bào/ml tùy theo từng loại tế bào thử nghiệm).
Chuẩn bịmẫu thử
- Pha mẫu gốc (4 mg/mL) từ mẫu chiết thực vật trong dung môi dimethyl sulphoxide (DMSO). Do DMSO biểu hiện độc tính ở nồng độ cao, nên cần hòa loãng với môi trường ở nồng độ nhỏ.
Tiến hành thí nghiệm
- Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau: + Dãy đối chứng âm: DMSO 10%
+ Dãy đối chứng dương: chất chuẩn có khả năng diệt tế bào (ellipithine 0,01mM trong DMSO)
+ Dãy thí nghiệm: mẫu thử + dịch huyền phù tế bào - Phiến được ủ trong tủ CO2 ở 37oC trong 3 ngày.
Kết thúc thí nghiệm
- Tế bào sau khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh. Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit axetic 1% và rửa lại bằng axit axetic 1% để loại màu thừa; để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm Trisbazơ 10M trên máy lắc ngang.
Tính kết quả
- Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì được đánh giá là có hoạt tính.
Giá trị CS(%) được tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn - Độ lệch σ được tính theo công thức:
Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i; : giá trị OD trung bình; n: số giếng thử lặp lại Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± ) sẽ được chọn ra cho thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50.
Bước 2: Tìm giá trị IC50
Dùng giá trị CS% của 10 nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Các mẫu thô có giá trị IC50 ≤ 40 µg/ml được coi là có hoạt tính.
Các mẫu tinh có giá trị IC50 ≤ 20 µg/ml được coi là có hoạt tính.
2.5. Phương pháp đánh giá khả năng kích hoạt enzym caspase 3/7
Được thực hiện dựa trên bộ kit Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay (Promega) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Thực nghiệm được tiến hành tại Phòng thử nghiệm Hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ sinh học.
Cho 50 µl hỗn dịch tế bào LU–1 ra đĩa 96 giếng với nồng độ tế bào thích hợp. Nồng độ tế bào được khuyến cáo sử dụng là 2.105 tế bào/ml.
Tiếp theo bổ sung 50 µl mẫu thử ở các nồng độ vào các giếng thí nghiệm, chất đối chứng dương được sử dụng là Tamoxifen, đối chứng âm được bổ sung bằng 50