Chất bột màu trắng; ESI-MS: m/z 765 [M+Na]+ (C34H46O18, M = 742);
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) H: 3,09 (2H, m, H-1 và H-5), 4,67 (2H, d, J = 3,5 Hz, H-2 và H-6), 3,83 (2H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz, Ha-4 và Ha-8), 4,20 (2H, dd, J = 7,0, 9,0 Hz, Hb-4 và Hb-8), 6,66 (4H, s, H-2, H-6, H-2 và H-6), 3,76 (12H, s, 3,5,3,5-OMe), 4,88 (2H, d J = 7,5 Hz, H-1 và H-1), 3,20 (4H, H-2, H-3, H-2 và H-3), 3,13 (2H, H-4 và H-4), 3,04 (2H, m, H-5 và H-5), 3,41 (2H, dd, J = 4,5, 12,0 Hz, H-6 và H-6) và 3,60 (2H, dd, J = 1,5, 12,0 Hz, H-6 và H-6); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) C: 53,58 (C-1 và C-5), 85,03 (C-2 và C-6), 71,32 (C-4 và C-8), 133,72 (C-1 và 1), 104,22 (C-2, C-6, C-2 và C-6), 152,60 (C-3, C-5, C-3 và C-5), 137,08 (C-4 và C-4), 56,41 (3,5,3,5-OMe), 102,65 (C-1 và C-1), 74,14 (C-2 và C-2), 76,48 (C-3 và C-3), 69,91 (C-4 và C-4), 77,16 (C-5 và C-5) và 60,89 (C-6 và C-6).
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quy trình phân lập
Mẫu khô của P. scandens (2 kg) được chiết với MeOH bằng máy siêu âm Ultrasonic 2010 ở nhiệt độ 40-50oC trong vòng 30 phút. Dịch chiết sau đó được cô đặc bằng máy cất quay với áp suất giảm thu được 20 g cặn chiết MeOH. Cặn MeOH được hòa vào nước và phân lớp lần lượt với n-hexan và cloroform để thu được các dịch cô PS-H (20 g) và PS-C (40 g). Phần dịch nước PS-W sau chiết được cho qua cột dianion sử dụng hệ dung môi gradient MeOH-H2O (từ 0:100 đến 100:0) thu được các dịch cô W1 (9 g), W2 (22 g) và W3 (8,6 g).
Cặn chiết cloroform (40g) bằng các kỹ thuật sắc ký cột pha thường, pha đảo đã phân lập được các hợp chất 01, 02 và 08, quy trình chi tiết được mô tả trong hình 4.1.
Lớp nước được tiến hành phân tách thô trên cột sắc ký với chất nhồi là Diaion HP-20 với hệ dung môi giải hấp tăng dần nồng độ MeOH trong nước cất (0%, 30%, 70% và 100%), loại bỏ phần rửa giải bằng nước 100% thu được ba phân đoạn ký hiệu là W1-W3.
Hình 4.2. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước W1 của cây P. scandens
Phân đoạn W1 được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo thu được các hợp chất 09, 10, 11, 12, 13, 16 và 18. Tương tự, từ phân đoạn W2 đã tách được các hợp chất 03, 04, 05, 06, 07, 14, 15, 17 và 19. Sơ đồ phân lập chi tiết các hợp chất từ phân đoạn W1 và W2 được trình bày trong hình 4.2 và 4.3.
4.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất
4.2.1. Hợp chất 01: Paramignyol A (Chất mới)
Hợp chất 01 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử của nó được xác định là C32H54O5 (M = 518) bằng kết quả phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 541,3890 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C32H54O5Na là 541,3869) và cho thấy trong cấu trúc có 6 đơn vị bất bão hòa (Hình PL1).
Hình 4.4. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 01
Trên phổ 1H-NMR (hình 4.4) của hợp chất 01 xuất hiện tín hiệu pic đơn của 7 nhóm metyl tại H 0,92 (H-18), 0,83 (H-19), 1,19 (H-26), 1,24 (H-27), 0,94 (H-28), 0,94 (H-29) và 1,03 (H-30) cùng với tín hiệu pic đôi của 1 proton metin olefin với
hằng số ghép đôi nhỏ tại H 5,30 (d, J = 3,0 Hz, H-7) cho thấy dạng khung tirucallan tương tự các hợp chất đã phân lập trước đây từ một số loài thuộc chi
Paramignya [21, 22, 34]. Ngoài ra còn có pic đơn của 2 nhóm metoxy ở H 3,37 (3H, s, 21-OMe) và 3,25 (3H, s, 25-OMe).
Hình 4.5. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất 01
Phổ 13C-NMR (hình 4.5) của hợp chất 01 xuất hiện tín hiệu của 32 cacbon trong đó có tín hiệu đặc trưng của 7 nhóm metyl bậc 3 tại C 23,5 (C-18), 13,5 (C- 19), 20,8 (C-26), 22,7 (C-27), 28,6 (C-28), 22,4 (C-29) và 27,8 (C-30); tín hiệu của 1 liên kết đôi tại C 119,5 (C-7) và 147,2 (C-8); tín hiệu của 1 cacbon bậc 4 nối với nguyên tử ôxy ở C 78,6 (C-25); 1 nhóm metin nối với 2 nguyên tử ôxy tại C 106,0 (C-21); tín hiệu của 3 nhóm oxymetin ở C 77,0 (C-3), 79,5 (C-23), 78,1 (C-24) cùng với tín hiệu của 2 nhóm metoxy C 55,2 (21-OMe) và 49,6 (25-OMe). Kết hợp với nhận xét từ phổ khối trong cấu trúc có 6 đơn vị bất bão hòa, còn trên phổ cacbon thấy xuất hiện tín hiệu của một nối đôi nên trong cấu trúc của hợp chất 01 sẽ có 5 vòng.
Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của 01 tương tự với phổ NMR của agladupol D [31]chỉ khác là xuất hiện thêm tín hiệu của một nhóm metoxy trong 01. Tương tác của các proton trên các cacbon đứng cạnh nhau được thể hiện trên phổ COSY (hình PL2) cho thấy liên kết đôi ở vị trí C7=C8 thể hiện qua tương tác giữa H2-6 (H
1,96/2,06)/H-7 (H 5,30); vòng 21,23-epoxy thể hiện qua các tương tác H-17 (H
2,04)/H-20 (H 2,02), H-20/H-21 (H 4,74), H-20/H2-22 (H 1,74/1,99), H-22/H-23 (H 4,35), H-23/H-24 (H 3,28).
Tương tác trên phổ HMBC (hình PL4) của proton trong 2 nhóm metyl H3-26 (H 1,19)/H3-27 (H 1,24) với C-25 (C 78,6) cũng như của proton trong nhóm metoxy ở H 3,25 với C-25 (C 78,6) khẳng định nhóm metoxy này nối với C-25. Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HMBC và COSY (hình 4.7) cho phép xác định cấu trúc phẳng của 01.
Độ chuyển dời hóa học của C-3 trên phổ 13C-NMR ở C 77,0 tương tự với agladupol D [31] ở C 76,1, nhưng khác với C-3 của hợp chất 21,23-epoxy-21- methoxytirucall-7-ene-3,24,25-triol [29] với C 79,2 cho thấy nhóm hydroxy nối với C-3 theo cấu hình . Điều này cũng được xác định thêm khi thấy tín hiệu của proton H-3 xuất hiện ở dạng pic đơn rộng, ngược lại với đa pic trong trường hợp nhóm hydroxy nối với C-3 theo cấu hình [29]. Tương tự, cấu hình của nhóm metoxy ở C-21 (C 106,0) cũng giống như trong hợp chất agladupol D [31] với C
104,8 và khác với agladupol E ở C 108,9. Các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR cùng với phổ HSQC (hình PL3) của đoạn cấu trúc từ C-23 đến C-27 trong 01 tương tự với agladoral E [35] cho thấy hai hợp chất này có cùng cấu hình ở C-23 và C-24.
Thêm vào đó, cấu hình tương đối của 01 cũng được khẳng định thêm thông qua phổ NOESY (hình 4.6). Proton H-20 (H 2,02) có tương tác NOE với H-21 (H
4,74) và H-23 (H 4,35) khẳng định rằng H-20, H-21 và H-23 đều có cấu hình . Các tương tác NOESY chính của hợp chất 01 được thể hiện trên hình 4.8. Do đó cấu trúc của 01 được khẳng định là 21,23-epoxy-21,25-dimethoxytirucall-7-ene- 3,24-diol, đây là hợp chất mới và được đặt tên là paramignyol A.
Hình 4.6. Phổ NOESY của hợp chất 01
HMBC COSY
Hình 4.7. Các tương tác COSY và HMBC chính của hợp chất 01
Hình 4.8. Tương tác NOESY chính của hợp chất 01
Cấu trúc hóa học của hợp chất 01 được thể hiện trên hình 4.9 và độ dịch chuyển hóa học chi tiết của cacbon và proton được thể hiện trên bảng 4.1.
Bảng 4.1.Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 01 C aC bC cC Cd,e Hd,fdạng pic (J, Hz) HMBC (H C) 1 37,2 31,6 32,44 1,38 m/1,55 m 2 27,7 25,3 26,43 1,60 m/1,96 m 3 79,2 76,1 76,98 3,41 br s 1, 5 4 39,0 37,3 38,34 - 5 50,7 44,5 45,80 1,82 dd (6,5, 11,0) 6 24,0 23,8 25,02 1,96 m/2,06 m 7 118,2 118,1 119,53 5,30 br d (3,0) 8 145,4 145,6 147,16 - 9 48,8 48,3 49,82 2,43 m 10 35,0 34,7 35,86 - 11 17,7 17,4 18,63 1,55 m/1,65 m 8 12 31,2 31,1 32,54 1,43 m/1,92 m 13 43,5 43,5 44,71 - 14 50,7 50,9 52,97 - 15 34,2 34,3 35,31 1,52 m/1,61 m 16 27,3 27,3 28,25 1,40 m/1,90 m 17 45,0 50,2 46,41 2,04 m 21 18 23,2 22,5 23,54 0,92 s 12, 13, 14, 17 19 13,1 12,9 13,54 0,83 s 1, 5, 9, 10 20 46,2 46,3 47,7 47,92 2,02 m 21 109,2 104,9 108,9 105,99 4,74 br d (3,0) 17, 23, OMe 22 35,5 31,6 33,7 33,81 1,74 m/1,99 m 23 75,0 78,8 76,6 79,52 4,35 m 24 76,2 76,6 75,4 78,09 3,28 d (3,5) 25 77,0 72,9 73,0 78,57 - 26 20,1 26,4 26,4 20,78 1,19 s 24, 25, 27 27 21,6 26,3 26,3 22,70 1,24 s 24, 25, 26 28 27,6 27,7 28,56 0,94 s 3, 4, 5, 29 29 14,7 21,7 22,36 0,94 s 3, 4, 5, 28 30 27,3 27,1 27,85 1,03 s 8, 13, 14,15 21-OMe 55,4 55,2 55,6 55,20 3,37 s 21 25-OMe 49,1 49,57 3,25 s 25 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
aC của agladoral E [35], bC của 21,23-epoxy-21-methoxytirucall-7-ene-3,24,25-triol [29], cC của agladupol E [31], d đo trong CD3OD, e125 MHz, f500 MHz.
Hình 4.9. Cấu trúc hóa học của hợp chất 01
4.2.2. Hợp chất 02: Paramignyol B (Chất mới)
Hợp chất 02 được phân lập dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng. Công thức phân tử của nó được xác định là C32H54O5 (M = 518) bằng kết quả phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 541,3883 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C32H54O5Na là 541,3869) và cho thấy trong cấu trúc có 6 đơn vị bất bão hòa (Hình PL5).
Hình 4.10. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 02
Trên phổ 1H-NMR (hình 4.10) của hợp chất 02 xuất hiện các tín hiệu pic đơn của 7 nhóm methyl tại H 0,92 (H-18), 0,83 (H-19), 1,20 (H-26), 1,26 (H-27), 0,93
(H-28), 0,93 (H-29) và 1,04 (H-30). Ngoài ra còn có pic đơn của 2 nhóm metoxy ở
H 3,35 (3H, s, 21-OMe) và 3,25 (3H, s, 25-OMe).
Hình 4.11. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất 02
Khi so sánh với độ dịch chuyển hóa học của các proton trong hợp chất 01 đã nêu ở trên, nhận thấy đa số các tín hiệu đều trùng khớp, ngoại trừ độ dịch chuyển hóa học của các proton ở C-21 đến C-24 có sự thay đổi chứng tỏ vòng 21,23-epoxy có sự thay đổi về cấu hình.
Phổ 13C-NMR của hợp chất 02 (hình 4.11) xuất hiện các tín hiệu trùng khớp khi so sánh với độ dịch chuyển hóa học của các cacbon trong hợp chất 01 đã nêu ở trên, ngoại trừ độ dịch chuyển hóa học của các cacbon 20, 21, 22 dịch chuyển về trường thấp hơn và độ dịch chuyển hóa học của các cacbon 23, 24 dịch chuyển về trường cao hơn chứng tỏ vòng 21,23-epoxy có sự thay đổi về cấu hình. Có lẽ ở nhóm methoxy nối với C-21 theo cấu hình vì độ chênh lệch khoảng 4 ppm.
Phổ COSY (hình PL6), HSQC (hình PL7), HMBC (hình PL8) của 02tương tự với các phổ NMR của hợp chất 01, phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HMBC và COSY (hình 4.13) cho phép xác định cấu trúc phẳng của 02.
Thêm vào đó, cấu hình tương đối của 02 cũng được khẳng định thêm thông qua phổ NOESY (hình 4.12). Proton H-21 (H 4,81) có tương tác NOE với H-17 (H
1,86) nhưng không có tương tác với H-20 (H 2,18) khẳng định cấu hình của H- 21. Các tương tác NOESY chính của hợp chất 02 thể hiện trên hình 4.14.
Hình 4.12. Phổ NOESY của hợp chất 02
HMBC COSY
Hình 4.13. Các tương tác COSY và HMBC chính của hợp chất 02
Do đó cấu trúc của 02 được khẳng định là 21,23-epoxy-21,25- dimethoxytirucall-7-ene-3,24-diol, đây là hợp chất mới và được đặt tên là paramignyol B (hình 4.15). Các dữ liệu NMR của 02 được trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 02 C aC bC cC Cd,e Hd,f dạng pic (J, Hz) HMBC (H C) 1 37,2 31,6 32,45 1,38 m/1,57 m 2 27,7 25,3 26,46 1,60 m/1,97 m 3 79,2 76,1 76,98 3,41 br s 1, 5 4 39,0 37,3 38,35 - 5 50,7 44,5 45,78 1,82 m 6 24,0 23,8 25,02 1,98 m/2,07 m 7 118,2 118,1 119,53 5,30 br d (3,5) 8 145,4 145,6 147,13 - 9 48,8 48,3 49,86 2,43 m 10 35,0 34,7 35,88 - 11 17,7 17,4 18,63 1,57 m/1,65 m 8 12 31,2 31,1 32,98 1,62 m/1,85 m 13 43,5 43,5 44,85 - 14 50,7 50,9 52,17 - 15 34,2 34,3 34,96 1,52 m/1,62 m 16 27,3 27,3 28,40 1,36 m/1,95 m 17 45,0 50,2 51,18 1,86 m 21 18 23,2 22,5 23,04 0,92 s 12, 13, 14, 17 19 13,1 12,9 13,54 0,83 s 1, 5, 9, 10 20 46,2 46,3 47,7 49,00 2,18 m 21 109,2 104,9 108,9 110,19 4,81 dd (3,0, 6,5) 17, 23, OMe 22 35,5 31,6 33,7 36,85 1,61 m/1,99 m 23 75,0 78,8 76,6 76,62 4,17 m 24 76,2 76,6 75,4 76,75 3,37 d (3,5) 25 77,0 72,9 73,0 78,73 - 26 20,1 26,4 26,4 20,83 1,20 s 24, 25, 27 27 21,6 26,3 26,3 22,56 1,26 s 24, 25, 26 28 27,6 27,7 28,57 0,93 s 3, 4, 5, 29 29 14,7 21,7 22,38 0,93 s 3, 4, 5, 28 30 27,3 27,1 27,75 1,04 s 8, 13, 14,15 21-OMe 55,4 55,2 55,6 55,68 3,35 s 21 25-OMe 49,1 49,28 3,25 s 25
aC của agladoral E [35], bC của 21,23-epoxy-21-methoxytirucall-7-ene-3,24,25-triol [29], cC của agladupol E [31], d đo trong CD3OD, e 125 MHz, f 500 MHz
Hình 4.15. Cấu trúc hóa học của hợp chất PS15
4.2.3. Hợp chất 03: Paramignyoside A (Chất mới)
Hợp chất 03 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử của nó được xác định là C42H66O17 (M = 842) bằng kết quả phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (hình PL9) tại m/z 865,4233 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C42H66O17Na+ là 865,4192).
Trên phổ 1H-NMR (hình 4.16) của hợp chất 03 xuất hiện tín hiệu pic đơn của 6 nhóm metyl tại H 0,91 (H-18), 0,74 (H-19), 1,26 (H-26), 1,24 (H-27), 1,31 (H- 28) và 1,03 (H-30) cùng với tín hiệu pic đôi của 1 proton metin olefin với hằng số ghép đôi nhỏ tại H 5,30 (d, J = 2,5 Hz, H-7) cho thấy dạng khung tirucallan tương tự hợp chất paramignyol đã phân tích ở trên, ngoại trừ không có tín hiệu của nhóm metyl ở C-29. Ngoài ra còn có pic đơn của 2 nhóm metoxy ở H 3,37 (3H, s, 21- OMe) và 3,25 (3H, s, 25-OMe). Hai proton anome ở H 5,88 (1H, d, J = 8,0 Hz, H- 1) và 4,59 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1) có tương tác với 2 cacbon anome ở C 95,0 (C- 1) và 105,1 (C-1) trên phổ HSQC (hình PL10).
Hình 4.17. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất 03
Phổ 13C-NMR (hình 4.17) của hợp chất 03 xuất hiện tín hiệu của 42 cacbon của khung triterpen và gốc đường. So sánh các giá trị chuyển dịch hóa học 13C- NMR của gốc đường (bảng 4.3) với các giá trị tương ứng của hợp chất ()-4-[β-D- glucopyranosyl-(13)-β-D-glucopyranosyloxy]benzyl alcohol [36] và kết hợp với
việc thủy phân axit cũng như phân tích phổ COSY (hình 4.18) và HMBC (hình PL 11) cấu trúc của phần đường là β-D-glucopyranosyl-(13)-β-D-glucopyranoside.
Phổ 13C-NMR của phần aglycon cho tín hiệu đặc trưng của 6 nhóm metyl bậc 3 tại C 23,8 (C-18), 12,8 (C-19), 26,7 (C-26), 26,4 (C-27), 24,3 (C-28) và 27,9 (C- 30); tín hiệu của 1 liên kết đôi 3 lần thế tại C 119,5 (C-7) và 145,6 (C-8); tín hiệu của 1 cacbon bậc 4 nối với nguyên tử ôxy ở C 72,8 (C-25); 2 cacbon carbonyl tại
C 181,3 (C-21) và 176,6 (C-29); tín hiệu của 3 nhóm oxymetin ở C 71,4 (C-3), 80,2 (C-23), 78,1 (C-24). Dữ liệu phổ NMR của 03 tương tự với dữ liệu phổ của mesendanin M [37] ngoại trừ việc thay thế nhóm oximetilen trong mesendanin M bằng nhóm cacbonyl trong 03. Vị trí của nhóm cacbonyl thay thế ở C-29 được xác nhận bởi tương tác HMBC của H-5 (H 2,06) và H-28 (H 1,31) với C-29 (C
176,6). Ngoài ra, tương tác mạnh giữa proton anome H-1 (H 5,88) với C-29 (C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
176,6) cho thấy chuỗi hai gốc đường gắn vào cacbon này. Phân tích chi tiết các tương tác COSY và HMBC được trình bày trong hình 4.20.
Cấu hình không gian của 03 được thiết lập khi so sánh các giá trị phổ NMR và hằng số ghép đôi với các hợp chất tương tự [37-39] cùng với phân tích trên phổ ROESY (hình 4.19). Tương tác ROESY của proton H-3 ở H 4,10 (1H, d, J = 2,5 Hz) và cacbon C-3 ở C 71,4 cho thấy cấu hình của H-3 [37, 38]. Cấu hình của nhóm metyl C-28 ở C 24,3 khác với cấu hình β của nhóm metyl C-28 trong hợp chất so sánh [39] ở C 17,5 cũng như khi quan sát tương tác của H-28 (H 1,31) với H-5 (H 2,06)/Hα-6 (H 2,20) và tương tác của Hβ-6 (H 2,84) với H-19 (H 0,74) trên phổ ROESY.
Do đó cấu trúc của 03 đã được khẳng định, đây là hợp chất mới và được đặt tên là Paramignyoside A.
Hình 4.20. Cấu trúc hóa học và tương tác COSY, HMBC và ROESY chính của hợp chất 03
Cấu trúc hóa học của hợp chất 03 được thể hiện trên hình 4.20 và độ dịch chuyển hóa học chi tiết của cacbon và proton được thể hiện trên bảng 4.3.
Bảng 4.3.Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 03 C aC bC Cc,d Hc,e Dạng pic (J = Hz) HMBC (H C) 1 32,4 32,99 1,42 m/1,54 m 2 26,2 27,78 1,67 m/2,28 m 3 71,1 71,38 4,10 d (2,5) 1, 4, 5 4 43,5 49,55 - 5 46,7 46,49 2,06 m 4, 6, 10, 19, 29 6 24,7 25,41 2,20 m/2,84 m 7 119,5 119,55 5,31 d (2,5) 8 146,9 145,64 -
9 50,0 49,12 2,41 m 10 35,7 36,35 - 11 32,4 18,88 1,56 m/1,69 m 8 12 32,3 32,44 1,79 m 13 44,8 44,80 - 14 51,7 51,74 - 15 35,0 34,94 1,57 m/1,64 m