2.4.1. Mục tiêu và cơ sở lý thuyết
Hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư và không ung thư in vitro của các mẫu chiết, cũng như để kiểm tra độc tính của thuốc với các dòng tế bào ung thư và không ung thư. Phép thử này dựa vào khả năng SRB bám vào protein của tế bào đã được cố định bởi axit trichloroaxetic (TCA). SRB là chất nhuộm aminoxanthene hồng nhạt với 2 nhóm sulfonic tác dụng gắn với các chất chứa amino acid cơ bản trong điều kiện axit nhẹ,
và tách ra trong điều kiện kiềm. Lượng chất màu tách ra từ tế bào được nhuộm là tương ứng với số lượng tế bào.
Độ mạnh của sự bám dính SRB cho phép phản ứng thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng. Phản ứng SRB được chứng minh là có tính ứng dụng bởi lớp tế bào sau khi cố định bởi TCA và nhuộm với SRB có thể được lưu giữ lâu dài. Chất mầu tách ra từ tế bào nhuộm SRB là bền vững. Với tính nhạy cao, sử dụng với phiến 96 giếng và tính bền vững, phản ứng SRB là phù hợp với ứng dụng sàng lọc lớn cũng như trong nghiên cứu.
2.4.2. Vật liệu
Các dòng tế bào
Các dòng tế bào sử dụng trong thực nghiệm hoạt tính sinh học được lưu giữ tại Phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Hai dòng tế bào đại diện để thử nghiệm hoạt tính của các mẫu chiết là:
Dòng RD: ung thư mô liên kết Dòng Hep- G2: ung thư gan
Môi trường nuôi tế bào
Môi trường nuôi các dòng tế bào ung thư:
- Môi trường MEME (Minineal Essential Medium with Eagle’s salts), 7-10% huyết thanh bê tươi và dịch kháng sinh PSF (potassium penicillin - streptomycin - fungizone), NAA (nonessential amino acid).
- Môi trường DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium), 10% huyết thanh bê tươi và dịch kháng sinh PSF, NAA.
- Dịch kháng sinh PSF: 100 đơn vị penixilin/ml, 100 g streptomyxin sunfat/ml, 0,25 g amphoterixin B/ml.
2.4.3. Phương pháp tiến hành
Nuôi tế bào ung thư in vitro theo Skehan và cs. Xác định hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhiwitayawuid và cs. đang được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI). Phương pháp này
đã được phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm 1996. Phép xác định gồm hai bước như sau:
Bước 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính
Chuẩn bị tế bào
- Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng MEME, Eagle hoặc DMEM.
- Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (CO2 5%; độ ẩm 98%; nhiệt độ 37oC, vô trùng tuyệt đối), tế bào được hoạt hoá trước khi thí nghiệm tiến hành từ 18-24 giờ.
- Dùng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa tế bào bằng đệm PBS. Pha tế bào bằng môi trường sạch, đếm số lượng, tạo huyền dịch tế bào ở nồng độ thí nghiệm (khoảng 3-5x104 tế bào/ml tùy theo từng loại tế bào thử nghiệm).
Chuẩn bịmẫu thử
- Pha mẫu gốc (4 mg/mL) từ mẫu chiết thực vật trong dung môi dimethyl sulphoxide (DMSO). Do DMSO biểu hiện độc tính ở nồng độ cao, nên cần hòa loãng với môi trường ở nồng độ nhỏ.
Tiến hành thí nghiệm
- Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau: + Dãy đối chứng âm: DMSO 10%
+ Dãy đối chứng dương: chất chuẩn có khả năng diệt tế bào (ellipithine 0,01mM trong DMSO)
+ Dãy thí nghiệm: mẫu thử + dịch huyền phù tế bào - Phiến được ủ trong tủ CO2 ở 37oC trong 3 ngày.
Kết thúc thí nghiệm
- Tế bào sau khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh. Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit axetic 1% và rửa lại bằng axit axetic 1% để loại màu thừa; để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm Trisbazơ 10M trên máy lắc ngang.
Tính kết quả
- Tính giá trị CS % (% Cell Survival) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giá trị CS là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì được đánh giá là có hoạt tính.
Giá trị CS(%) được tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn - Độ lệch σ được tính theo công thức:
Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i; : giá trị OD trung bình; n: số giếng thử lặp lại Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± ) sẽ được chọn ra cho thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50.
Bước 2: Tìm giá trị IC50
Dùng giá trị CS% của 10 nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Các mẫu thô có giá trị IC50 ≤ 40 µg/ml được coi là có hoạt tính.
Các mẫu tinh có giá trị IC50 ≤ 20 µg/ml được coi là có hoạt tính.
2.5. Phương pháp đánh giá khả năng kích hoạt enzym caspase 3/7
Được thực hiện dựa trên bộ kit Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay (Promega) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Thực nghiệm được tiến hành tại Phòng thử nghiệm Hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ sinh học.
Cho 50 µl hỗn dịch tế bào LU–1 ra đĩa 96 giếng với nồng độ tế bào thích hợp. Nồng độ tế bào được khuyến cáo sử dụng là 2.105 tế bào/ml.
Tiếp theo bổ sung 50 µl mẫu thử ở các nồng độ vào các giếng thí nghiệm, chất đối chứng dương được sử dụng là Tamoxifen, đối chứng âm được bổ sung bằng 50 µl dung môi pha mẫu. Ủ mẫu 5h ở 37oC, 5% CO2.
Thêm 100 µl Apo-ONE® Caspase-3/7 Reagent cho tất cả các giếng thí nghiệm. Để đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian từ 1- 18 h. Đọc kết quả trên máy Tecan GENios Pro microplate reader, đo cường độ huỳnh quang (fluorescence – RFU) ở bước sóng: 485 ± 20 nm (excitation wavelength range) và 530 ± 25 nm (emission wavelength). Khả năng kích hoạt enzyme caspase 3 và 7 của mẫu được đánh giá thông qua công thức:
Hoạt tính caspase (RFU) = Giá trị RFU của mẫu thử - Giá trị RFU của đối chứng âm
2.6. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm: 2.6.1. Nuôi cấy tế bào 2.6.1. Nuôi cấy tế bào
Tế bào đuôi gai từ tủy xương (BMDC) được phát triển từ chuột hoang dại C57BL/6 của công ty Orient Bio Inc. như mô tả trong tài liệu [33]. Các quá trình này được thực hiện theo hướng dẫn của Ban sử dụng và chăm sóc động vật của Trường Đại học Quốc gia Jeju (Hàn Quốc) (#2010-0028). Trong một thời gian ngắn, xương chày và xương đùi chuột được rửa với môi trường DMEM để thu được các tế bào tủy xương. Các tế bào này được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% huyết thanh bào thai bò (FBS; Gibco), 50 μM β-ME, 2 mM glutamin và bổ sung 3% tế bào lai J558L chứa tác nhân kích thích bạch cầu hạt và đại thực bào. Môi trường nuôi cấy được thay thế bởi môi trường mới hai ngày một lần. Vào ngày thứ 6 của quá trình nuôi cấy, các tế bào không dính và các khối DC dính chặt với nhau được thu, rửa và huyền phù lại trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 5% FBS.
2.6.2. Đo Cytokine
BMDC được nuôi cấy trong đĩa 48 giếng 0,5 mL chứa 1×105 tế bào/giếng, và xử lý với các hợp chất cần thử hoạt tính ở nồng độ xác định trong thời gian 1 giờ trước khi được kích thích với 10 ng/mL LPS từ Salmonella minnesota (Alexis). Dịch nổi được thu sau 18 giờ. Nồng độ TNF-α, IL-6, và IL-12 p40 của chuột được xác định bằng cách đọc ELISA (BD PharMingen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Số liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình của ít nhất 3 lần lặp lại.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM 3.1. Điều chế các dịch chiết từ Paramignya scandens:
Mẫu lá cây xáo leo P. scandens sau khi thu hái được tiến hành loại bỏ tạp bẩn, phơi khô trong bóng râm và xay nhỏ thu được 2 kg bột khô. Bột này được tiến hành ngâm với 5 lít MeOH và tiến hành chiết 3 lần trên thiết bị chiết siêu âm (mỗi lần 60 phút). Các dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gộp lại và cô quay đến khối lượng không đổi trên thiết bị cô quay chân không thu được 200 g cặn chiết MeOH tổng. Cặn này được hòa vào 2 lit nước cất và chiết phân bố lần lượt với n-hexan và cloroform thu được các cặn chiết tương ứng PS-H (20g), PS-C (40g) và lớp nước PS-W (hình 3.1).
Hình 3.1. Sơ đồ tạo các dịch chiết từ cây P. scandens
Cặn MeOH 200 g Cặn hexanPS-H 20 g Lớp nước PS-W
Chiết phân bố Hexan/H2O
Cặn cloroform PS-C
40 g
Lớp nước
PS-W
3.2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học dịch chiết
Cắn chiết MeOH tổng của cây xáo leo (P. scandens) đã được thử hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư Hep-G2 và RD. Kết quả thử hoạt tính được trình bày trong bảng 3.1:
Bảng 3.1:Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào
trên cao metanoltoàn phần của cây Xáo leo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu Tỷ lệ (%) gây độc tế bào IC50 (g/ml)
Hep-G2 RD Hep-G2 RD
DMSO 100,0±0,0 100,0±0,0
Chứng (+) 0,2±0,0 2,5±0,2 0,23 0,19 Xáo leo (P. scandens) 6,1±0,9 23,8±0,06 6,45 13,88
Từ kết quả trên cho thấy cao metanol toàn phần của cây xáo leo có hoạt tính kháng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro khá mạnh, đặc biệt trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2.
3.3. Nghiên cứu hóa học cây P. scandens
3.3.1. Quy trình phân lập
Cặn chiết cloroform (40g) cho qua cột hấp phụ Silicagel dùng hệ dung môi giải hấp CH2Cl2-MeOH tăng dần nồng độ MeOH từ 0 đến 100% cho 8 phân đoạn từ C1-C8.
Phân đoạn C4 tiếp tục cho qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH-H2O=2/1 thu được 3 phân đoạn C4A (130 mg), C4B (400 mg), C4C (25 mg).
Phân đoạn C4B sau khi qua cột Sephadex LH-20 với hệ MeOH-H2O (2/1) thu được các phân đoạn C4B1, C4B2, C4B3. Hợp chất PS01 (30 mg) được tinh chế từ phân đoạn C4B3.
Từ phân đoạn C5 (4,7g) tiếp tục cho qua cột hấp phụ Silica gel dùng hệ dung môi giải hấp CH2Cl2-MeOH gradient tỷ lệ tăng dần từ 25/1đến 0/100 cho 4 phân đoạn từ C5A-C5D. Phân đoạn C5A (1,2 g) cho qua cột silica gel pha đảo với hệ
dung môi giải hấp là MeOH-H2O (1/1) thu được C5A2 tuy nhiên chất này trùng với PS01. Phân đoạn C5B (2 g) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi hexan-ethyl axetat (5/1) thu được 5 phân đoạn từ C5B1-C5B5. Phân đoạn C5B1 (46 mg) cho qua cột Sephadex LH-20 với hệ MeOH-H2O (2/1) thu được C5B1A (26 mg), tiếp tục qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH-H2O (8/1) thu được hai chất PS15 (10 mg) và PS16 (5 mg). Tương tự hợp chất PS18 (5 mg) thu được từ phân đoạn C5B5 (46 mg) sau khi qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (15/1).
Phân đoạn C8 (2,5 g) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi hexan-ethyl axetat (2/1) tiếp tục thu được 5 phân đoạn từ C8A-C8G. Phân đoạn C8G (240 mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (10/1) thu được hợp chất PS09 (4 mg).
Lớp nước được tiến hành phân tách thô trên cột sắc ký với chất nhồi là Diaion HP-20 với hệ dung môi giải hấp tăng dần nồng độ MeOH trong nước cất (0%, 30%, 70% và 100%), loại bỏ phần rửa giải bằng nước 100% thu được ba phân đoạn ký hiệu là W1-W3.
Phân đoạn W1 (9g) được phân tách thành 05 phân đoạn nhỏ ký hiệu là W1A- W1E bằng sắc ký cột silica gel pha thường giải hấp bằng CHCl3/MeOH (20/1-0/1).
Phân đoạn W1B (350 mg) được cho qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH-H2O (1/3) thu được 3 phân đoạn từ W1B1 - W1B3, phân đoạn W1B3 (29 mg) tiếp tục cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CHCl3/MeOH/H2O (9/1/0,03) thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS03 (6 mg).
Bằng phương pháp tương tự, phân đoạn W1C (1,3 g) được cho qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH-H2O (1/4) thu được 4 phân đoạn từ W1C1-W1C4, phân đoạn W1C2 (700 mg) tiếp tục cho qua cột Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1/2) thu được 5 phân đoạn từ W1C2A-W1C2F, phân đoạn W1C2A (85 mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CHCl3/ MeOH/H2O (7/1/0,05) thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS09 (5 mg). Từ phân đoạn W1C2B (85 mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi
CHCl3/MeOH/H2O (9/1/0,03) thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS02 (5 mg), hợp chất PS05 (7mg) được tách từ phân đoạn W1C2C (120 mg) với hệ dung môi rửa giải là CHCl3/MeOH/H2O (9/1/0,03). Hai hợp chất PS23, PS10 cũng được tách từ hai phân đoạn W1C2D (95 mg) và W1C2F (90 mg) với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2-MeOH (10/1).
Từ phân đoạn W1D (1,2 g), dùng cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH- H2O (1/4) thu được 2 phân đoạn W1D1-W1D2, phân đoạn W1D1 (480 mg) qua cột Sephadex LH-20 với hệ MeOH-H2O (1/3) thu được W1D1A, W1D1B, W1D1C. Từ phân đoạn W1D1B tiếp tục qua cột silica gel pha thường với hệ dung môi giải hấp là CH2Cl2-MeOH (10/1) thu được hợp chất PS20 (4 mg).
Phân đoạn W2 được phân tách tiếp thành 08 phân đoạn nhỏ ký hiệu là W2A- W2H bằng sắc ký cột silica gel pha thường sử dụng dung môi rửa giải tăng dần nồng độ MeOH trong diclorometan (1/20-1/0). Tinh chế phân đoạn W2C (1g) bằng sắc ký cột silica gel pha thường kết hợp với sắc ký rây phân tử sử dụng sephadex LH-20 thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS18 (3 mg). Tương tự, phân đoạn W2D (1,8 g) cho qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH- H2O (1/3) thu được 8 phân đoạn từ W2D1-W2D8, phân đoạn W2D3 (120mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (7/1) thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS13 (6 mg), tương tự hợp chất PS21 (2 mg) được tinh chế từ phân đoạn W2D4 bằng sắc ký cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (7/1) và hợp chất PS25 (3 mg) được tinh chế từ phân đoạn W2D5 bằng sắc ký cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi ethyl axetat-MeOH (6/1).
Từ phân đoạn W2G (2,5g), sử dụng cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH-H2O (1,5/1) thu được 5 phân đoạn từ W2G1-W2G5, phân đoạn W2G3 (280mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O (4/1/0,1) thu được các hợp chất sạch ký hiệu là PS31 (5 mg),
PS32 (4mg), PS28 (3,5mg). Với phân đoạn W2G4 (450mg) dùng sắc ký cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O (3/1/0,1) kết hợp với
sắc ký rây phân tử sử dụng sephadex LH-20 thu được các hợp chất sạch ký hiệu là
PS29 (4,5 mg) và PS 30 (5mg).
3.3.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được: 3.3.2.1. Hợp chất 01 (PS16): Paramignyol A (Chất mới) 3.3.2.1. Hợp chất 01 (PS16): Paramignyol A (Chất mới)
C32H54O5, M = 518, HR-ESI-MS: m/z 541,3890 [M+Na]+, tính toán lý thuyết 541,3869 cho công thức C32H54O5Na+ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD):1,38 (1H, m, Ha-1), 1,55 (1H, m, Hb-1), 1,60 (1H, m, Ha-2), 1,96 (1H, m, Hb-2), 3,41 (1H, br s, H-3), 1,82 (1H, dd, J = 6,5, 11, 0 Hz, H-5), 1,96 (1H, m, Ha-6), 2,06 (1H, m, Hb-6), 5,30 (1H, br d, J = 3,0, H-7), 2,43 (1H, m, H-9), 1,55 (1H, m, Ha-11),1,65 (1H, m, Hb-11), 1,43 (1H, m, Ha-12), 1,92 (1H, m, Hb-12), 1,52 (1H, m, Ha-15), 1,61 (1H, m, Hb-15), 1,40 (1H, m, Ha- 16), 1,90 (1H, m, Hb-16), 2,04 (1H, m, H-17), 0,92 (3H, s, H-18), 0,83 (3H, s, H- 19), 2,02 (1H, m, H-20), 4,74 (1H, br d, J = 3,0 Hz, H-21), 1,74 (1H, m, Ha-22), 1,99 (1H, m, Hb-22), 4,35 (1H, m, H-23), 3,28 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-24), 1,19 (3H, s, H-26), 1,24 (3H, s, H-27), 0,94 (6H, s, H-28, H-29), 1,03 (3H, s, H-30), 3,37 (3H, s, 21-OMe), 3,25 (3H, s, 25-OMe); 13C-NMR (125MHz, CDCl3/CD3OD): 32,44 (C-1), 26,43 (C-2), 76,98 (C-3), 38,34 (C-4), 45,80 (C-5), 25,02 (C-6), 119,53 (C-7), 147,16 (C-8), 49,82 (C-9), 35,86 (C-10), 18,63 (C-11), 32,54 (C-12), 44,71 (C-13), 52,97 (C-14), 35,31 (C-15), 28,25 (C-16), 46,41 (C-17), 23,54 (C-18), 13,54 (C-19), 47,92 (C-20), 105,99 (C- 21), 33,81 (C-22), 79,52 (C-23), 78,09 (C-24), 78,57 (C-25), 20,78 (C-26), 22,70 (C-27), 28,56 (C-28), 22,36 (C-29), 27,85 (C-30), 55,20 (21-OMe), 49,57 (25- OMe). 3.3.2.2. Hợp chất 02 (PS15): Paramignyol B (Chất mới)
C32H54O5, M = 518, HR-ESI-MS: m/z 541,3883 [M+Na]+, tính toán lý thuyết 541,3869 cho công thức C32H54O5Na+
1H-NMR (500 MHz, CD3OD):1,38 (1H, m, Ha-1), 1,57 (1H, m, Hb-1), 1,60 (1H, m, Ha-2), 1,97 (1H, m, Hb-2), 3,41 (1H, br s, H-3), 1,82 (1H, m, H-5), 1,98 (1H, m, Ha-6), 2,07 (1H, m, Hb-6), 5,30 (1H, br d, J = 3,5, H-7), 2,43 (1H, m, H-9),
1,57 (1H, m, Ha-11), 1,65 (1H, m, Hb-11), 1,62 (1H, m, Ha-12), 1,85 (1H, m, Hb- 12), 1,52 (1H, m, Ha-15), 1,62 (1H, m, Hb-15), 1,36 (1H, m, Ha-16), 1,95 (1H, m, Hb-16), 1,86 (1H, m, H-17), 0,92 (3H, s, H-18), 0,83 (3H, s, H-19), 2,18 (1H, m, H- 20), 4,81 (1H, dd, J = 3,0, 6,5 Hz, H-21), 1,61 (1H, m, Ha-22), 1,99 (1H, m, Hb- 22), 4,17 (1H, m, H-23), 3,37 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-24), 1,20 (3H, s, H-26), 1,26 (3H, s, H-27), 0,93 (6H, s, H-28, H-29), 1,04 (3H, s, H-30), 3,35 (3H, s, 21-OMe), 3,25 (3H, s, 25-OMe); 13C-NMR (125MHz, CDCl3/CD3OD): 32,45 (C-1), 26,46 (C-2), 76,98 (C-3), 38,35 (C-4), 45,78 (C-5), 25,02 (C-6), 119,53 (C-7), 147,13 (C-8), 49,86 (C-9), 35,88 (C-10), 18,63 (C-11), 32,98 (C-12), 44,85 (C-13), 52,17 (C-14), 34,96 (C-15), 28,40 (C-16), 51,18 (C-17), 23,04 (C-18), 13,54 (C-19), 49,00 (C-20), 110,19 (C- 21), 36,85 (C-22), 76,62 (C-23), 76,75 (C-24), 78,83 (C-25), 20,83 (C-26), 22,56 (C-27), 28,57 (C-28), 22,38 (C-29), 27,75 (C-30), 55,68 (21-OMe), 49,28 (25- OMe). 3.3.2.3. Hợp chất 03 (PS31): Paramignyoside A (Chất mới)
C42H66O17, M = 842, HR-ESI-MS: m/z 865,4233 [M+Na]+, tính toán lý thuyết 865,4192 cho công thức C42H66O17Na+ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD):1,42 (1H, m, Ha-1), 1,54 (1H, m, Hb-1), 1,67 (1H, m, Ha-2), 2,28 (1H, m, Hb-2), 4,10 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-3), 2,06 (1H, m, H- 5), 2,20 (1H, m, Ha-6), 2,84 (1H, m, Hb-6), 5,31 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-7), 2,41 (1H, m, H-9), 1,56 (1H, m, Ha-11), 1,69 (1H, m, Hb-11), 1,79 (2H, m, H-12), 1,57 (1H, m, Ha-15), 1,64 (1H, m, Hb-15), 1,60 (1H, m, Ha-16), 1,82 (1H, m, Hb-16), 2,38 (1H, m, H-17), 0,91 (3H, s, H-18), 0,74 (3H, s, H-19), 2,83 (1H, m, H-20), 2,29 (1H, m, Ha-22), 2,31 (1H, m, Hb-22), 4,68 (1H, m, H-23), 3,63 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-24), 1,26 (3H, s, H-26), 1,24 (3H, s, H-27), 1,31 (3H, s, H-28), 1,07 (3H, s, H- 30), 5,88 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1), 3,58 (1H, dd, J = 8,0, 9,0 Hz, H-2), 3,64 (1H, m, H-3), 3,52 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-43,44 (1Hm H-5), 3,74 (1H, dd, J = 4,5, 12,0 Hz, Ha-6), 3,86 (1H, br d, J = 12,0 Hz, Hb-6), 4,59 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1), 3,32 (1H, m, H-2), 3,41 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-3), 3,31 (1H, m, H-4), 3,37 (1H, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
m, H-5), 3,67 (1H, dd, J = 6,0, 12,0 Hz, Ha-6), 3,92 (1H, dd, J =1,5, 12,0 Hz, Ha- 6); 13C-NMR (125MHz, CD3OD) : 32,99 (C-1), 27,78 (C-2), 71,38 (C-3), 49,55 (C-4), 46,49 (C-5), 25,41 (C-6), 119,55 (C-7), 145,64 (C-8), 49,12 (C-9), 36,35 (C- 10), 18,88 (C-11), 32,44 (C-12), 44,80 (C-13), 51,74 (C-14), 34,94 (C-15), 24,77