Tiến hành nuụi cấy E.coli BL21 mang gen gerF ở 370C, chế độ lắc 200 vũng/ phỳt trong khoảng thời gian từ 16-18h đến khi đạt OD 0.6-0.8, tabổ xung IPTG ở cỏc nồng độ khỏc nhau 5mmol; 10mmol và 15mmol và tăng sinh trong nhiệt độ 260C trong 10h, sau đú tỏch protein thụ để kiểm tra khả năng biểu hiện gen từ vật chủ
M : Marker đơn vị Kb
Mẫu 1: Ezyme nội bào gerF ở nồng độ IPTG là 15 mmol Mẫu 2: Enzyme nội bào gerF ở nồng độ IPTG là 10mmol Mẫu 3: Enzyme nội bào gerF ở nồng độ IPTG là 5mmol Nhận xột:
- Qua hỡnh ảnh điện di protein tế bào tỏi tổ hợp của mẫu E.coli BL21 DE3 mang gen gerF đó được biểu hiện đỳng như khối lượng của enzyme này là 38 kDa
- Khối lượng này bao gồm cả khối lượng của đoạn 6xHis•Tag axit amin và protein thioredoxin với khối lượng là 16kDa, hai đoạn này là những thành phần được mó húa bởi đoạn gen liờn kết với gen gerF nằm trong vector biểu hiện pET-32a(+)
- Kết quả điện di cho thấy ở nồng độ IPTG là 10mmol (cựng điều kiện nhiệt độ và thời gian) thỡ vạch protein cú khối lượng 38 kDa là đậm nhất, chứng tỏ ở nồng độ IPTG này thỡ enzyme nội bào được biểu hiện nhiều nhất
- Ta tiến hành tỡm điều kiện thớch hợp mà vi sinh vật cú khả năng tạo enzyme tan nhiều nhất ở nồng độ IPTG thớch hợp là 10mmol
3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ biểu hiện
Tiến hành nuụi cấy E.coli BL21 mang gen gerF ở 370C, đến khi đạt OD 0.6-0.8, sau đú biểu hiện E.coli BL21 mang gen gerF ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau lần lượt là: 220C, 240C, 280C, 300C , bổ sung thờm IPTG với nồng độ đó được nghiờn cứu là 10mmol nuụi trong thời gian như nhau là 6h
Hỡnh 15 : Điện di enzyme gerF ở cỏc điều kiện nhiệt độ khỏc nhau M : Marker đơn vị Kb
Mẫu 1: Enzyme nội bào gerF biểu hiện ở 300C Mẫu 2: Enzyme nội bào gerF biểu hiện ở 280C Mẫu 3: Enzyme nội bào gerF biểu hiện ở 240C Mẫu 4: Enzyme nội bào gerF biểu hiện ở 220C Nhận xột:
Qua kết quả điện di ta thấy ở nhiệt độ 300C cho kết quả là lượng enzyme gerF cú được biểu hiện trong nội bào vật chủ biểu hiện tuy nhiờn lượng enzyme được biểu hiện tại nhiệt độ này thấp. Cũng cú nhiều ý kiến cho rằng với điều kiện nhiệt độ cao thỡ protein biểu hiện mạnh và khụng kịp biến đổi nờn thành dạng khụng tan dớnh ở thành tế bào.
Ở điều kiện nhiệt độ 280C cho kết quả là lượng enzyme cú mặt trong nội bào lớn tuy nhiờn lượng enzyme nội bào được biểu hiện nhiều nhất khụng phải là enzyme gerF cú khối lượng đỳng như khối lượng đó tớnh toỏn của là 38 kDa
Cũn ở điều kiện nhiệt độ là 220C và 240C lượng enzyme cú mặt trong nội bào được biểu hiện là lớn và đạt kớch thước 38 kDa như mong muốn và ở 220C thỡ lượng enzyme nội bào được biểu hiện lớn nhất do vạch điện di đậm hơn
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến biểu hiện protein
Tiến hành nuụi cấy E.coli BL21 mang gen gerF ở 370C chế độ lắc 200 vũng/ phỳt trong khoảng thời gian từ 16-18h đến khi đạt OD 0.6-0.8, ta biểu hiện E.coli BL21mang gen gerF ở cỏc thời gian khỏc nhau là 6h và 10h, bổ sung thờm IPTG với nồng độ đó được nghiờn cứu là 10mmol nuụi trong cựng điều kiện nhiệt độ đó được nghiờn cứu là thớch hợp để biểu hiện protein nội bào ta là 220C, ở thớ nghiệm này ta tiến hành biểu hiện ở cỏc mức thời gian khỏc nhau là 6h và 10h.
M : Marker
Mẫu 1: Thời gian biểu hiện 6h Mẫu 2: Thời gian biểu hiện 10h Nhận xột:
Kết quả điện di trờn hỡnh cho ta thấy: Thời gian biểu hiện gen của tế bào vật chủ trong thời gian là 6h thỡ kết quả biểu hiện enzyme cú mặt trong nội bào thấp. Trong khi đú thời gian biểu hiện là 10h thỡ thấy lượng enzyme biểu hiện trong nội bào là cao và đỳng như khối lượng đó tớnh toỏn là 38 kDa
Từ những kết quả trờn ta nhận thấy rằng tại điều kiện nuụi cấy 220C trong 10h và nồng độ IPTG là 10mmol vi khuẩn E.coliBL 21 DE3(gerF) biểu hiện enzyme gerF là tốt nhất.
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 4.1. Kết luận
Từ những kết quả thu được của đề tài nghiờn cứu tụi đó cú những kết luận như sau:
1. Vật chủ biểu hiện E.coli BL21 DE3 đó chứa gen gerF vector biểu hiện pET- 32a(+)
2. Điều kiện thớch hợp để biểu hiện gen GerF và enzyme này được sinh ra ở dạng tan ở 220C, trong thời gian thớch hợp là 10h, nồng độ IPTG thớch hợp cho biểu hiện enzyme tan nội bào là 10mmol
3. Đỏnh giỏ trỡnh tự gen mó húa cho trỡnh tự axit amin cú chức năng enzyme dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3-epimerase, tạo đồng phõn quang học cho phõn tử đường dTDP-D-Allose ở vị trớ cac bon C3
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. TS. Cao Văn Thu, (2000), Bài giảng khỏng sinh và vitamin.
2. TS.Trương Thị Minh Hạnh, 2007, Cụng nghệ dược phẩm, Nxb Đà Nẵng. 3. PGS. TS. Đặng Thị Thu, PGS. Lờ Ngọc Tỳ, TS. Tụ Kim Anh, PGS. TS.
Phạm Thu Thủy, TS. Nguyễn Xuõn Sõm, Cụng nghệ enzyme, Nxb Khoa học
kỹ thuật
4. TS. Tạ Thị Thu Thủy, Biosynthesis pathway of dihydrochalcomycin, luận ỏn tiến sĩ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5. PGS. TS. Khuất Hữu Thanh, (1956-2006), Kỹ thuật gen nguyờn lý và ứng dụng, Nxb Khoa học và kỹ thuật.
6. Quyền Đỡnh Thi, (2005), Cụng nghệ sinh học tập I, Nxb Khoa học và kỹ thuật.
7. Vừ Thị Thương Lan, (2008), Giỏo trỡnh sinh học phõn tử và ứng dụng, Nxb Khoa học và kỹ thuật.
8. Henninger, T.C.,(2003), Expert Opin. Ther. Part. 13, 787-805. 9. Poehlsgaard, J., Douthwait, S., (2002) Curent Drug Targets
10.Kirst, H. A.,Sides, G.D., (1998) Antimicrob. Agents Chemother., 33, 1313- 1418.
11.Xuemei, M., Liu, H, W., (2002) Annu. Rew. Biochem., 71, 701-754
12.Liu, C., Smith, B.M., Ajito, K.,Komatsu, H., Gome, P.L., (1996) Proc.Natr.Acad.Sci. USA, 93, 940-944
13. Hansen, J.L., Ippolito, J.A., Ban, N., Nissen, P., Moore, P. B., Steitz, T.A., (2002), Mol.Cell., 10, 117-128.
14. Agouridas, C., Denis, A., aogar, J.M., Beniditti, Y., bonnefoy, A., Bretin, F., Chatot, J. F., Dusarat, A., Fromentin, C., D’Ambriere, S.G., Lachaud, S., Laurin, P., LeMartret, O., Loyau, V., Tessot, N., (1998) J.Med. Chem., 41, 4080-4100
15. Sambrook J, Russell DW, (2001), Molecular cloning a laboratoty manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor laborary Press, New York.
16. Sunmoon Unniversity chemistry biolad, (1999), Genetic manipulation of streptomyces and E.coli.
17. Robert A. Copeland, (1994), Methods for protein analysis, first pudlished by Chapman & Hall One Penn Plaza New York, NY 10119, Publish in Great Britain by Chapman and Hall, 2-6 Boundary Row London SE1 8HN.
18. Blaberu, (1998), molecular biology and biotechnology, Springer Verlag. Trang web tham khảo:
19. http://wikipedia.org/wiki/Kh %C3%A1ngsinh#C.C6.A1ch.E1.BA.BF_t.C3.Alc_E1.BB.A7a_Kh.C3.A1ng_ sinh 20. http://vi.wikipedia.org/wiki/Enzyme_gi%E1%BB%9Bi_h%E1%BA %A1n. 21. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19590827 22. http://springerlink.com/content/e174548174873352 23. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 24. http://wwwp.ifcc.org/PDF/publication/eJIFCC/vol120/04/eJIFCC_v20_0 4_05.pdf/