Plasmid là những phõn tử DNA nhỏ, mạch vũng cú khả năng tỏi bản độc lập và cú kớch thước 0,05-10% kớch thước của NST vi khuẩn. Plasmid cú vai trũ quan trọng trong cỏc nghiờn cứu về cụng nghệ DNA tỏi tổ hợp. Chỳng được làm vector để chuyển cỏc đoạn gen ngoại lai và tế bào vật chủ.
1. Vật liệu và húa chất
- Vật liệu: Vi khuẩn E.Coli mang vector cần tỏch chiết
- Húa chất: Dung dịch sol I, sol II, sol III, đệm TE, isopropanol hoặc ethanol lạnh 100%, ethanol lạnh 70%.
2. Cỏc bước tiến hành
Bước 1: Nuụi lắc 16- 18h vi khuẩn E.Coli trong 3ml mụi trường LB lỏng cú bổ sung Amp tỉ lệ 1àg/ml, ở 370C, tốc độ lắc 200 vũng/phỳt, đến khi OD đạt 0,6-0.8 là thớch hợp để tỏch chiết DNA plasmid
Bước 2: Cho dịch nuụi tế bào vào ống eppendoft 1.5-2 ml, ly tõm với tốc 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở nhiệt độ phũng. Sau đú loại bỏ dịch nuụi, giữ lại phần xỏc tế bào.
Bước 3: Hũa tan tế bào trong 200àl dung dịch sol I bằng mỏy voltex để ở nhiệt độ phũng trong 5 phỳt.
Bổ sung 200àl dung dịch sol II vào ống eppendoft trờn, đảo ngược nhẹ nhàng ống eppendoft khi dung dịch trong suốt là được.
Bổ sung thờm 200àl sol III để lạnh, tiếp tục đảo ngược nhẹ nhàng để xuất hiện kết tủa trắng.
Bước 4: Ly tõm ống eppendoft bằng mỏy ly tõm với vận tốc 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở nhiệt độ phũng.
Dựng pipet hỳt phần dịch trong bờn trờn sang một ống eppendoft mới loại bỏ phần cặn phớa dưới.
Bước 5: Bổ sung thờm 0,6 ml isopropanol ở -200C hoặc ethanol lạnh 100% vào ống eppendoft chứa dịch vừa thu được ly tõm với vận tốc 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở nhiệt độ phũng hỳt bỏ hết phần dịch bằng pipet, phần cặn cũn lại trong ống eppendoft là DNA. Bổ sung 0,5 ml cồn ở -200C vào ống chứa DNA, lắc đều rồi ly tõm 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở nhiệt độ phũng. Thao tỏc lần hai để rửa sạch DNA.
Bước 6: DNA tinh sạch được để cho bay hết hơi cồn và nước ở nhiệt độ phũng trong vũng 1-2h, rồi bổ sung thờm 20àl nước cất hoặc TE buffer bảo quản ở -40C.