1. Nguyờn tắc:
Điện di trờn gel polyacrylamide kỹ thuật để phõn tỏch cỏc protein theo khối lượng phõn tử chiều dài của chuỗi polypeptide, cấu hỡnh xoắn của protein và cỏc nhõn tố khỏc [5]
2. Thiết bị và húa chất
- Mỏy chạy điện di protein, pipet, đầu cụn, cồn vệ sinh, găng tay,... - 30% acrylamide/ 0,8% bisacrylamide - 4X Tris-Cl/SDS, pH=6.8 - Tris Cl/SDS, pH=8.8 - 5X SDS/electrophoresis buffer - 2X SDS/sample buffer - 10% Amoni persulfat - TEMED 3. Cỏch tiến hành
Chuẩn bị đổ gel cú nồng độ 5% của Acrylamide.
Đổ gel lớp tỏch(gel tra protein), tỉ lệ theo bảng sau:[17]
30% acrylamide/0.8 bisacrylamide 2.5ml 4X Tris-Cl/SDS, pH=8.8 3.75ml Nước 8.75ml 10% amoni persulfat 0.05ml TEMED 0.01ml
Bước 1: Cho húa chất vào ống phalcon 15ml hoặc cốc thủy tinh, trộn đều dung dịch của lớp gel tỏch, dựng pipet hỳt và bơm dung dịch vào buồng gel khi lớp gel cỏch mộp trờn bản thủy tinh 1.5-2cm. Trong quỏ trỡnh đổ gel nờn trỏnh khụng để cho bọt khớ cũn lại trong lớp gel.
Bước 2: Phủ một lớp nước hoặc n-propanol lờn trờn bề mặt lớp gel vừa đổ để tạo đường phõn cỏch giữa hai lớp gel. Quỏ trỡnh polyme húa sẽ hoàn thành từ 1-3h.
Đổ gel lớp stacking ( lớp cụ đặc), tỉ lệ theo bảng:[17]
30%acrylamide/0.8 bisacrylamide 0.65ml
4X Tris-Cl/SDS, pH=6.8 1.25ml
Nước 3.05ml
10% amoni persulfat 25àl
TEMED 5àl
Hỡnh 6: Sơ đồ điện di protein trờn gel acrylamide
Bước 3: Khi lớp gel đó đụng hoàn toàn, hỳt bỏ lớp nước phớa trờn và đổ tiếp lớp Stacking gel lờn trờn cho tới khi đầy buồng gel đặt lược vào buồng sao cho khụng tạo bọt khớ dưới chõn lược tạo cỏc giếng tra mẫu, quỏ trỡnh polyme húa lớp gel này khoảng 30 phỳt.
Sau khi lớp gel thứ 2 đó đụng nhẹ nhàng gỡ lược ra khỏi bản gel và khuụn kớnh ra khỏi khung cố định rồi đặt khuụn kớnh đú vào thiết bị chạy điện di.
Chuẩn bị dung dịch chạy điện di: Dung dịch chạy điện di protein là dung dịch 1X SDS/ electrophoresis buffer
- Ta thờm nước cất vào dung dịch 5X SDS/electrophoresis buffer để tạo thành dung dịch 1X SDS/ electrophoresis buffer.
- Dung dịch nhuộm bản gel là 0.1% coomassie Blue R-250 được pha theo tỉ lệ Methanol: glacial acetic acid: nước =5:5:1
Bước 4: chạy điện di:
Đổ ngập dung dịch điện di 1XSDS/electrophoresis buffer lờn toàn bộ bản gel trong buồng điện di sao cho dung dịch ngập bản gel 1-2mm.
Mẫu protein: lấy 10àl protein, 5àl PBL, SDS 10% cho vào ống eppendoft cho mẫu vào nước núng 950C trong 5 phỳt để làm biến tớnh protein. Lấy mẫu tra lần lượt vào cỏc giếng trong bản gel rồi chạy điện di ở hiệu điện thế 130V đến khi mẫu chạy gần hết bản gel cỏch đỏy 1cm
Bước 5: Nhuộm bản gel:
Chạy điện di xong bản gel được nhuộm bằng dung dịch 0.1% coomassie Blue R-250 được lọc qua giấy whatman ở 500C trong thời gian 30 phỳt.
Bước 6: Tẩy màu:
Cho bản gel vào trong dung dịch chứa Methanol: nước ( tỉ lệ 45% : 55%) lắc nhẹ trong 30 phỳt rồi đổ dung dịch vừa rửa đi.
Pha dung dịch 5% (v/v) methanol, 7% (v/v) acid acetic, 88% (v/v) nước để loại bỏ màu. Cho bản gel vào lắc cho đến khi bản gel mất màu là được.
Bước 7: Tẩy màu bản gel xong bản gel được chuyển vào giấy lọc whatman sấy khụ ở 800C trong 80 phỳt hoặc scan hay chụp ảnh. Dựa vào kết quả chạy điện di protein này để đỏnh giỏ và phõn tớch biểu hiện gen.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phõn tớch trỡnh tự axit amin của gen gerF
Gen gerF mó húa cho enzyme dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3- epimerase. Kết quả giải trỡnh tự được thể hiện ở hỡnh và được so sỏnh bằng phần mền BLAST trờn địa chỉ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Trỡnh tự nucleotid thu được khi ta đem so sỏnh với trỡnh tự cỏc gen cú chức năng tương tự trờn ngõn hàng gen NBCI thỡ thấy trỡnh tự này tương đồng 100% với trỡnh tự nucleotid đó được cụng bố trờn ngõn hàng gen thế giớivới
mó số ABB52524.1 thuộc chủng streptomyces sp, KCTC
0041BPdihydrochalcomycin. Cú độ tương đồng 99% so với gen của chủng
streptomyces sp. Mg1 và cú độ tương đồng 96% so với gen của chủng
streptomyces bikiniensis (Hỡnh 7)
Hỡnh 7: So sỏnh trỡnh tự nucleotide gen gerF với trỡnh tự của một số gen cú chức năng dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3-epimerase trong ngõn hàng gen
thế giới NCBI.
Chỉ đỏnh giỏ về độ tương đồng về nucleotid thỡ chưa đủ, ta cần phải cú cỏc phõn tớch đỏnh giỏ về trỡnh tự axit amin và cấu trỳc enzyme này. Trỡnh tự nucleotid được chuyển thành trỡnh tự axit amin bằng phương phỏp sử dụng phần mềm BLAST so sỏnh với trỡnh tự axit amin đó được đăng ký trờn ngõn hàng gen thế giới, trỡnh tự axit amin khi giải trỡnh tự như sau:
MHPLSIEGAWSQEPVIHSDHRGRSHEWFRGERFRQTFGHDFPV AQVNVAVSHRGALRGIHYTEIPPGQAKYSVCVRGAGLDVIVDVRIGS PTFGRWEIVPMDAERNTAVYLAAGLGRAFLSLTDDATLVYLCSSGYA PEREHSVNPLDPDLGIVWPADIEPLLSDRDKNAPTLATAERLGLLPT
Hỡnh 8: So sỏnh trỡnh tự axit amin gerF với gen cú cựng chức năng của chủng Streptomyces, KCTC 0041BP đăng ký trờn ngõn hàng gen
Hỡnh 9: So sỏnh trỡnh tự axit amin gerF với gen cú cựng chức năng của
streptomyces sp. Mg1 đăng ký trờn ngõn hàng gen
Hỡnh 10: So sỏnh trỡnh tự axit amin gerF với gen cú cựng chức năng của
streptomyces bikiniensis đó đăng ký trờn ngõn hàng gen
Hỡnh 11: Trỡnh tự axit amin của gerF với cỏc enzyme cú cựng chức năng của xạ khuẩn khỏc đăng ký trờn ngõn hàng gen
Mg1: Trỡnh tự aa gen cú cựng chức năng của streptomyces sp. Mg1
Biki : Trỡnh tự axit amin gen cú cựng chức năng của streptomyces bikiniensis
Kết luận: So sỏnh trỡnh tự axit amin của gerF với cỏc enzyme cú cựng chức năng của một số chủng xạ khuẩn khỏc bằng phương phỏp sử dụng phần mềm ClustalX đó chỉ ra độ tương đồng về cỏc gốc axit amin. Từ sự tương đồng đú ta cú thể dự đoỏn được chức năng của gen gerF (hỡnh 11)
Hỡnh 12: Sơ đồ biểu hiện gen gerF vào vật chủ E.coli BL 21 DE3
Để kiểm tra lại kết quả chuyển gen gerF vào vector biểu hiện pET32a(+), nuụi tăng sinh chủng E.coli BL21 DE3 đó mang gen gerF trong mụi trường LB lỏng cú bổ sung khỏng sinh Amp nồng độ 1àg/ml, ở 370C, chế độ lắc 200 vũng/phỳt trong 16-18h. Khi OD = 0.6-0.8 tiến hành tỏch plasmid, plasmid này được cắt bằng hai enzyme giới hạn BamHI/EcoRI theo cụng thức:
Enzyme BamHI : 1,5 àl Enzyme EcoRI : 1,5àl Plasmid :20àl
H2O : 4àl
Tổng cộng: 30àl
Thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 370C trong 1h. Kiểm tra mẫu cắt bằng phương phỏp điện di agarose
Hỡnh 13: Kết quả điện di sản phẩm chuyển gen gerF vào vector biểu hiện pET-32a(+)
Trong đú: M là marker đơn vị Bp ( thang chuẩn DNA)
Đường chạy từ 1-3: Là mẫu plasmid pGerF được cắt bởi enzyme EcoR1
Với độ dài vector pET32-a(+) là 5900Bp(5.9 Kb), độ dài vector gerF là588bp(~0.59Kb). Điều này chứng tỏ E.coli BL21 cú chứa gen GerF đó được chuyển thành cụng vào tế bào vật chủ E.coli BL21 DE3.
3.3. Kết quả biểu hiện enzyme GerF
Để tỡm điều kiện thớch hợp mà vi sinh vật cú khả năng tạo enzyme tan nội bào là nhiều nhất ta tiến hành thớ nghiệm ở cỏc điều kiện khỏc nhau gồm cú: Nồng độ IPTG thớch hợp, nhiệt độ, thời gian thớch hợp cho vật chủ được chuyển gen biểu hiện enzyme tan nội bào là lớn nhất
3.3.1. Nồng độ IPTG để biểu hiện
Tiến hành nuụi cấy E.coli BL21 mang gen gerF ở 370C, chế độ lắc 200 vũng/ phỳt trong khoảng thời gian từ 16-18h đến khi đạt OD 0.6-0.8, tabổ xung IPTG ở cỏc nồng độ khỏc nhau 5mmol; 10mmol và 15mmol và tăng sinh trong nhiệt độ 260C trong 10h, sau đú tỏch protein thụ để kiểm tra khả năng biểu hiện gen từ vật chủ
M : Marker đơn vị Kb
Mẫu 1: Ezyme nội bào gerF ở nồng độ IPTG là 15 mmol Mẫu 2: Enzyme nội bào gerF ở nồng độ IPTG là 10mmol Mẫu 3: Enzyme nội bào gerF ở nồng độ IPTG là 5mmol Nhận xột:
- Qua hỡnh ảnh điện di protein tế bào tỏi tổ hợp của mẫu E.coli BL21 DE3 mang gen gerF đó được biểu hiện đỳng như khối lượng của enzyme này là 38 kDa
- Khối lượng này bao gồm cả khối lượng của đoạn 6xHis•Tag axit amin và protein thioredoxin với khối lượng là 16kDa, hai đoạn này là những thành phần được mó húa bởi đoạn gen liờn kết với gen gerF nằm trong vector biểu hiện pET-32a(+)
- Kết quả điện di cho thấy ở nồng độ IPTG là 10mmol (cựng điều kiện nhiệt độ và thời gian) thỡ vạch protein cú khối lượng 38 kDa là đậm nhất, chứng tỏ ở nồng độ IPTG này thỡ enzyme nội bào được biểu hiện nhiều nhất
- Ta tiến hành tỡm điều kiện thớch hợp mà vi sinh vật cú khả năng tạo enzyme tan nhiều nhất ở nồng độ IPTG thớch hợp là 10mmol
3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ biểu hiện
Tiến hành nuụi cấy E.coli BL21 mang gen gerF ở 370C, đến khi đạt OD 0.6-0.8, sau đú biểu hiện E.coli BL21 mang gen gerF ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau lần lượt là: 220C, 240C, 280C, 300C , bổ sung thờm IPTG với nồng độ đó được nghiờn cứu là 10mmol nuụi trong thời gian như nhau là 6h
Hỡnh 15 : Điện di enzyme gerF ở cỏc điều kiện nhiệt độ khỏc nhau M : Marker đơn vị Kb
Mẫu 1: Enzyme nội bào gerF biểu hiện ở 300C Mẫu 2: Enzyme nội bào gerF biểu hiện ở 280C Mẫu 3: Enzyme nội bào gerF biểu hiện ở 240C Mẫu 4: Enzyme nội bào gerF biểu hiện ở 220C Nhận xột:
Qua kết quả điện di ta thấy ở nhiệt độ 300C cho kết quả là lượng enzyme gerF cú được biểu hiện trong nội bào vật chủ biểu hiện tuy nhiờn lượng enzyme được biểu hiện tại nhiệt độ này thấp. Cũng cú nhiều ý kiến cho rằng với điều kiện nhiệt độ cao thỡ protein biểu hiện mạnh và khụng kịp biến đổi nờn thành dạng khụng tan dớnh ở thành tế bào.
Ở điều kiện nhiệt độ 280C cho kết quả là lượng enzyme cú mặt trong nội bào lớn tuy nhiờn lượng enzyme nội bào được biểu hiện nhiều nhất khụng phải là enzyme gerF cú khối lượng đỳng như khối lượng đó tớnh toỏn của là 38 kDa
Cũn ở điều kiện nhiệt độ là 220C và 240C lượng enzyme cú mặt trong nội bào được biểu hiện là lớn và đạt kớch thước 38 kDa như mong muốn và ở 220C thỡ lượng enzyme nội bào được biểu hiện lớn nhất do vạch điện di đậm hơn
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến biểu hiện protein
Tiến hành nuụi cấy E.coli BL21 mang gen gerF ở 370C chế độ lắc 200 vũng/ phỳt trong khoảng thời gian từ 16-18h đến khi đạt OD 0.6-0.8, ta biểu hiện E.coli BL21mang gen gerF ở cỏc thời gian khỏc nhau là 6h và 10h, bổ sung thờm IPTG với nồng độ đó được nghiờn cứu là 10mmol nuụi trong cựng điều kiện nhiệt độ đó được nghiờn cứu là thớch hợp để biểu hiện protein nội bào ta là 220C, ở thớ nghiệm này ta tiến hành biểu hiện ở cỏc mức thời gian khỏc nhau là 6h và 10h.
M : Marker
Mẫu 1: Thời gian biểu hiện 6h Mẫu 2: Thời gian biểu hiện 10h Nhận xột:
Kết quả điện di trờn hỡnh cho ta thấy: Thời gian biểu hiện gen của tế bào vật chủ trong thời gian là 6h thỡ kết quả biểu hiện enzyme cú mặt trong nội bào thấp. Trong khi đú thời gian biểu hiện là 10h thỡ thấy lượng enzyme biểu hiện trong nội bào là cao và đỳng như khối lượng đó tớnh toỏn là 38 kDa
Từ những kết quả trờn ta nhận thấy rằng tại điều kiện nuụi cấy 220C trong 10h và nồng độ IPTG là 10mmol vi khuẩn E.coliBL 21 DE3(gerF) biểu hiện enzyme gerF là tốt nhất.
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 4.1. Kết luận
Từ những kết quả thu được của đề tài nghiờn cứu tụi đó cú những kết luận như sau:
1. Vật chủ biểu hiện E.coli BL21 DE3 đó chứa gen gerF vector biểu hiện pET- 32a(+)
2. Điều kiện thớch hợp để biểu hiện gen GerF và enzyme này được sinh ra ở dạng tan ở 220C, trong thời gian thớch hợp là 10h, nồng độ IPTG thớch hợp cho biểu hiện enzyme tan nội bào là 10mmol
3. Đỏnh giỏ trỡnh tự gen mó húa cho trỡnh tự axit amin cú chức năng enzyme dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3-epimerase, tạo đồng phõn quang học cho phõn tử đường dTDP-D-Allose ở vị trớ cac bon C3
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. TS. Cao Văn Thu, (2000), Bài giảng khỏng sinh và vitamin.
2. TS.Trương Thị Minh Hạnh, 2007, Cụng nghệ dược phẩm, Nxb Đà Nẵng. 3. PGS. TS. Đặng Thị Thu, PGS. Lờ Ngọc Tỳ, TS. Tụ Kim Anh, PGS. TS.
Phạm Thu Thủy, TS. Nguyễn Xuõn Sõm, Cụng nghệ enzyme, Nxb Khoa học
kỹ thuật
4. TS. Tạ Thị Thu Thủy, Biosynthesis pathway of dihydrochalcomycin, luận ỏn tiến sĩ.
5. PGS. TS. Khuất Hữu Thanh, (1956-2006), Kỹ thuật gen nguyờn lý và ứng dụng, Nxb Khoa học và kỹ thuật.
6. Quyền Đỡnh Thi, (2005), Cụng nghệ sinh học tập I, Nxb Khoa học và kỹ thuật.
7. Vừ Thị Thương Lan, (2008), Giỏo trỡnh sinh học phõn tử và ứng dụng, Nxb Khoa học và kỹ thuật.
8. Henninger, T.C.,(2003), Expert Opin. Ther. Part. 13, 787-805. 9. Poehlsgaard, J., Douthwait, S., (2002) Curent Drug Targets
10.Kirst, H. A.,Sides, G.D., (1998) Antimicrob. Agents Chemother., 33, 1313- 1418.
11.Xuemei, M., Liu, H, W., (2002) Annu. Rew. Biochem., 71, 701-754
12.Liu, C., Smith, B.M., Ajito, K.,Komatsu, H., Gome, P.L., (1996) Proc.Natr.Acad.Sci. USA, 93, 940-944
13. Hansen, J.L., Ippolito, J.A., Ban, N., Nissen, P., Moore, P. B., Steitz, T.A., (2002), Mol.Cell., 10, 117-128.
14. Agouridas, C., Denis, A., aogar, J.M., Beniditti, Y., bonnefoy, A., Bretin, F., Chatot, J. F., Dusarat, A., Fromentin, C., D’Ambriere, S.G., Lachaud, S., Laurin, P., LeMartret, O., Loyau, V., Tessot, N., (1998) J.Med. Chem., 41, 4080-4100
15. Sambrook J, Russell DW, (2001), Molecular cloning a laboratoty manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor laborary Press, New York.
16. Sunmoon Unniversity chemistry biolad, (1999), Genetic manipulation of streptomyces and E.coli.
17. Robert A. Copeland, (1994), Methods for protein analysis, first pudlished by Chapman & Hall One Penn Plaza New York, NY 10119, Publish in Great Britain by Chapman and Hall, 2-6 Boundary Row London SE1 8HN.
18. Blaberu, (1998), molecular biology and biotechnology, Springer Verlag. Trang web tham khảo:
19. http://wikipedia.org/wiki/Kh %C3%A1ngsinh#C.C6.A1ch.E1.BA.BF_t.C3.Alc_E1.BB.A7a_Kh.C3.A1ng_ sinh 20. http://vi.wikipedia.org/wiki/Enzyme_gi%E1%BB%9Bi_h%E1%BA %A1n. 21. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19590827 22. http://springerlink.com/content/e174548174873352 23. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 24. http://wwwp.ifcc.org/PDF/publication/eJIFCC/vol120/04/eJIFCC_v20_0 4_05.pdf/