Nguyờn tắc: Màng tế bào vi khuẩn E.Coli cú thể trở nờn khả biến khi được xử lý với Ca2+. Dưới tỏc dụng của CaCl2 màng tế bào đang ở thời kỳ
sinh trưởng trở nờn xốp, tạo điều kiện cho DNA cú thể chui qua lỗ màng vào tế bào.
1. Tiến hành
- Chủng vi khuẩn được cấy ria trờn mụi trường LB đặc và nuụi qua đờm ở 370C
- Tăng sinh cấp I: Dựng đầu tăm đó được hấp vụ trựng lấy một khuẩn lạc mọc riờng lẻ cho vào 3ml mụi trường LB lỏng đựng trong ống fancol 15ml, lắc qua đờm ở 370C, 200 vũng/phỳt
- Tăng sinh cấp II: Chuyển 0,5 ml dịch nuụi cấp I sang 50ml mụi trường LB lỏng trong bỡnh tam giỏc 250ml, lắc tiếp khoảng 3h đến khi OD610nm đạt 0,6-0,8 chuyển dịch nuụi cấy sang ống ly tõm đó giữ lạnh trờn đỏ.
Thường sử dụng chủng vi khuẩn tăng sinh cấp I để chuẩn bị tế bào khả biến: - 3ml tăng sinh cấp I ly tõm 6000 vũng/phỳt ở 00C trong 10 phỳt
- Loại dịch nuụi thu xỏc tế bào
- Hũa cặn nhẹ nhàng trong 1ml-2ml CaCl2 0,1M
- Tiếp tục ly tõm 6000 vũng/phỳt ở 00C trong 10 phỳt, loại bỏ CaCl2 và thu xỏc tế bào, hũa cặn nhẹ nhàng trong 1ml-2ml CaCl2 0,1M
- Sau đú ly tõm 6000 vũng/phỳt ở 00C trong 10 phỳt, loại bỏ CaCl2 thu xỏc tế bào, bổ sung 100àl CaCl2, hũa cặn nhẹ nhàng giữ trong đỏ lạnh 45 phỳt - Chia vào mỗi ống eppendoft 50àl dịch tế bào, bổ sung 50àl glycerol 60%, làm đụng lạnh nhanh bằng Nitơ lỏng và giữ ở -800C.
- Tế bào khả biến đó hoàn thành mỗi lần dựng lấy 1 ống cho 1 lần chuyển gen.
- Cấy trải trờn mụi trường LB đặc cú khỏng sinh và khụng cú khỏng sinh để kiểm tra.
2.4.2.2. Chuyển gen vào vi khuẩn E.coli BL21 DE3
- Sử dụng 100àl tế bào khả biến lưu trữ ở -800C, sau ró đụng cỏc tế bào phải được sử dụng hoặc vứt bỏ vỡ chỳng khụng thể tỏi đụng lạnh.
- Đặt ống eppendoft chứa tế bào khả biến trực tiếp vào nước đỏ ngay sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh -800C
- Khi cỏc tế bào khả biến đó tan hỳt 100àl dịch tế bào vào ống eppendoft cú chứa DNA sau đú voltex để chỳng hũa trộn đều với nhau, để lạnh trong vũng 30 phỳt.
- Lấy hỗn hợp này cho vào waterbath ở 420C trong 40 giõy để sốc nhiệt. Sốc nhiệt làm cho tế bào đúng lại và giữ lại cỏc DNA plasmid/cosmid.
- Ngay sau đú thờm vào mỗi ống 200àl LB lỏng vụ trựng, lắc ở 370C trong vũng 30 phỳt
- Cuối cựng lấy ra và cấy trải trờn mụi trường LB đặc cú khỏng sinh, cấy xong 5 phỳt với cho vào tủ ấm 370C trong 24h, khi đĩa thạch xuất hiện khuẩn lạc lấy khuẩn lạc đú để kiểm tra DNA plasmid.
2.4.3. Tỏch chiết DNA plasmid
Plasmid là những phõn tử DNA nhỏ, mạch vũng cú khả năng tỏi bản độc lập và cú kớch thước 0,05-10% kớch thước của NST vi khuẩn. Plasmid cú vai trũ quan trọng trong cỏc nghiờn cứu về cụng nghệ DNA tỏi tổ hợp. Chỳng được làm vector để chuyển cỏc đoạn gen ngoại lai và tế bào vật chủ.
1. Vật liệu và húa chất
- Vật liệu: Vi khuẩn E.Coli mang vector cần tỏch chiết
- Húa chất: Dung dịch sol I, sol II, sol III, đệm TE, isopropanol hoặc ethanol lạnh 100%, ethanol lạnh 70%.
2. Cỏc bước tiến hành
Bước 1: Nuụi lắc 16- 18h vi khuẩn E.Coli trong 3ml mụi trường LB lỏng cú bổ sung Amp tỉ lệ 1àg/ml, ở 370C, tốc độ lắc 200 vũng/phỳt, đến khi OD đạt 0,6-0.8 là thớch hợp để tỏch chiết DNA plasmid
Bước 2: Cho dịch nuụi tế bào vào ống eppendoft 1.5-2 ml, ly tõm với tốc 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở nhiệt độ phũng. Sau đú loại bỏ dịch nuụi, giữ lại phần xỏc tế bào.
Bước 3: Hũa tan tế bào trong 200àl dung dịch sol I bằng mỏy voltex để ở nhiệt độ phũng trong 5 phỳt.
Bổ sung 200àl dung dịch sol II vào ống eppendoft trờn, đảo ngược nhẹ nhàng ống eppendoft khi dung dịch trong suốt là được.
Bổ sung thờm 200àl sol III để lạnh, tiếp tục đảo ngược nhẹ nhàng để xuất hiện kết tủa trắng.
Bước 4: Ly tõm ống eppendoft bằng mỏy ly tõm với vận tốc 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở nhiệt độ phũng.
Dựng pipet hỳt phần dịch trong bờn trờn sang một ống eppendoft mới loại bỏ phần cặn phớa dưới.
Bước 5: Bổ sung thờm 0,6 ml isopropanol ở -200C hoặc ethanol lạnh 100% vào ống eppendoft chứa dịch vừa thu được ly tõm với vận tốc 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở nhiệt độ phũng hỳt bỏ hết phần dịch bằng pipet, phần cặn cũn lại trong ống eppendoft là DNA. Bổ sung 0,5 ml cồn ở -200C vào ống chứa DNA, lắc đều rồi ly tõm 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở nhiệt độ phũng. Thao tỏc lần hai để rửa sạch DNA.
Bước 6: DNA tinh sạch được để cho bay hết hơi cồn và nước ở nhiệt độ phũng trong vũng 1-2h, rồi bổ sung thờm 20àl nước cất hoặc TE buffer bảo quản ở -40C.
2.4.4. Điện di DNA agarose gel1. Mục đớch: 1. Mục đớch:
Là một trong những phương phỏp sử dụng để phõn tỏch cỏc đoạn DNA cú kớch thước khỏc nhau, xỏc định được sự cú mặt của DNA quan tõm.
2. Nguyờn tắc:
DNA tớch điện õm khụng đổi nhờ khung photphate vỡ thế dưới tỏc động của điện trường cỏc phõn tử DNA sẽ di chuyển từ cực õm sang cực dương và cỏc DNA khỏc nhau về kớch thước, khối lượng phõn tử, mức độ xoắn và đa dạng phõn tử(mạch thẳng hay mạch vũng) dần được tỏch nhau ra trờn trường điện di, cỏc đoạn DNA cú kớch thước càng nhỏ thỡ tốc độ di chuyển trờn trường điện di càng nhanh hơn. Sau khi điện di kết thỳc ta cú thể quan sỏt cỏc phõn tử DNA nhờ sử dụng thuốc nhuộm phỏt huỳnh quang như ethidium. Mỗi một băng điện di phản ỏnh một tập hợp phõn tử DNA cú cựng kớch thước.
3. Húa chất và vật liệu
- Mỏy chạy điện di agarose
- Gel agarose, dung dịch TAE x1 dựng để chạy điện di DNA - Đầu cụn, pipet,...
4. Cỏch tiến hành:
- Lấy 0,2-0,5g agarose vào 30ml dung dịch TAEx1(tỉ lệ: 6-7g agarose/1000ml TAE x1) vào bỡnh thủy tinh chịu nhiệt, lắc đều cho vào lũ vi súng 1-2 phỳt để agarose tan hết. Bổ sung thờm Ethylbromine tỉ lệ 1àl/10ml. Đổ dung dịch agarose này vào khay gel điện di cú cài sẵn lược thớch hợp để
tạo giếng tra DNA. Sau 30-60 phỳt gel đó đụng cứng gỡ ra và đặt vào bể điện di, đổ đệm TAE(x1) vào sao cho ngập mặt gel 1-2mm.
- Lấy 5àl DNA trộn đều với 1-2àl PBL, trộn nhẹ nhàng để khụng tạo bọt vỡ nếu tạo bọt khớ tra mẫu vào giếng trong gel mẫu sẽ bị bọt khớ đẩy hết ra ngoài. Sau đú tra mẫu vào giếng trong gel
- Chạy điện di với hiệu điện thế 110V, trong khoảng 25-30 phỳt
- Quan sỏt bản gel bằng mỏy soi gel được chiếu bằng tia UV, sau đú kết luận và chụp ảnh
2.4.5. Phương phỏp biểu hiện protein trong E.coli BL21-DE3
Tăng sing cấp I: Lấy 3ml mụi trường LB lỏng cú bổ sung 3àg Amp cho vào ống phalcon 15ml, nuụi chủng vi sinh vật đó được chuyển gen gerF trong mỏy lắc vận tốc 200 vũng/phỳt, ở nhiệt độ 370C, từ 16-18h.
Tăng sinh cấp II: Lấy 30ml mụi trường LB lỏng cú bổ sung 30àg Amp cho vào bỡnh tam giỏc 250ml đó được khử trựng, tiếp theo cho 300àl giống tăng sinh cấp I vào nuụi trong mỏy lắc 200 vũng/phỳt.
Cỏc điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tạo protein tan nội bào (enzyme nội bào) là: Nồng độ IPTG biểu hiện(IPTG là chất cú khả năng điều hũa dương tớnh), điều kiện nhiệt độ biểu hiện và thời gian biểu hiện thớch hợp để khả năng tạo protein nội bào của vật chủ biểu hiện cao nhất
2.4.5.1. Biểu hiện protein ở cỏc nồng độ IPTG khỏc nhau
Với cỏc nồng độ IPTG khỏc nhau là 5àl, 10àl, 15àl, cho vào 3 bỡnh tam giỏc khỏc nhau trong thớ nghiệm này ta biểu hiện ở cựng nhiệt độ 260C và thời gian là 6h trong giai đoạn tăng sinh cấp II, khi mức độ tế bào đạt mật độ ta đo OD = 0.6-0.8
Mục đớch thay đổi nồng độ IPTG để tỡm ra được ở nồng độ IPTG nào thỡ khả năng tạo protein tan nội bào(enzyme nội bào) là cao nhất, sau khi đó tỡm ra được nồng độ IPTG thớch hợp nhất thỡ tỡm nhiệt độ và thời gian thớch hợp để biểu hiện protein
2.4.5.2. Biểu hiện protein ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau
Mục đớch của việc thay đổi nhiệt độ nuụi cấy là để tỡm được nhiệt độ nuụi cấy thớch hợp nhất để thu được enzyme tan nội bào mong muốn là cao
nhất. Tăng sinh cấp II tới khi mức độ tế bào đạt mật độ ta đo OD= 0.6-0.8 bổ sung IPTG với nồng độ thớch hợp đó được nghiờn cứu nuụi ở cỏc điều kiện nhiệt độ khỏc nhau:
- 220C - 240C - 280C - 300C
Sau khi cho IPTG vào tiếp tục nuụi lắc với vận tốc 200 vũng/phỳt, ở cỏc điều kiện nhiệt độ khỏc nhau như trờn, tuy nhiờn thời gian nuụi để thu nhận protein đều là 6h.
2.4.5.3. Biểu hiện protein ở cỏc điều kiện thời gian khỏc nhau
Mục đớch của việc thay đổi thời gian nuụi cấy là để tỡm được thời gian nuụi cấy thớch hợp nhất để thu được enzyme tan nội bào mong muốn là cao nhất. Tiến hành cấy tăng sinh cấp II ở cỏc điều kiện thời gian khỏc nhau với nhiệt độ thớch hợp và bổ sung nồng độ IPTG thớch hợp đó được nghiờn cứu. Tiếp tục nuụi trong mỏy lắc với vận tốc 200 vũng/phỳt và thời gian nuụi cấy là 6h và 10h
2.4.6. Phương phỏp tỏch protein thụ
Bước 1: Dịch nuụi cú chứa tế bào cho vào trong ống phalcon 50ml ly tõm với vận tốc 4000 vũng/ phỳt, ở điều kiện lạnh -40C trong 10 phỳt. Nhẹ nhàng loại bỏ dịch nuụi và thu xỏc tế bào lắng cặn phớa dưới.
Bước 2: Cho 5ml buffer lạnh vào, voltex để tế bào tan đều vào mụi trường buffer.
Bước 3: Ly tõm với vận tốc 4000 vũng/ phỳt, ở -40C, trong 10 phỳt. Nhẹ nhàng loại bỏ buffer thu phần xỏc tế bào ở dưới. Nhắc lại bước này ở cỏc điều kiện giống như trờn.
Bước 4: Thu phần xỏc tế bào, tiếp tục cho 1ml buffer vào voltex để tế bào tan đều. Dựng pipet vụ trựng hỳt dịch cho vào eppendoft giữ xỏc tế bào ở -200C.
Bước 5: Sử dụng thiết bị cụng phỏ mẫu là mỏy siờu õm 20 giõy/lần, 3-5 lần nhằm phỏ vỡ tế bào để dịch trong tế bào và enzyme nội bào được giải phúng để ta thu dịch.
Bước 6: Ly tõm mẫu thu được ở 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt, hỳt dịch nổi bờn trờn sang ống eppendoft loại bỏ xỏc tế bào ta thu được enzyme thụ
Chỳ ý:
Trong quỏ trỡnh ly tõm tế bào ta luụn làm trong điều kiện lạnh để đảm bảo khụng bị biến tớnh và làm giảm hoạt tớnh của enzyme.
2.5. Điện di protein1. Nguyờn tắc: 1. Nguyờn tắc:
Điện di trờn gel polyacrylamide kỹ thuật để phõn tỏch cỏc protein theo khối lượng phõn tử chiều dài của chuỗi polypeptide, cấu hỡnh xoắn của protein và cỏc nhõn tố khỏc [5]
2. Thiết bị và húa chất
- Mỏy chạy điện di protein, pipet, đầu cụn, cồn vệ sinh, găng tay,... - 30% acrylamide/ 0,8% bisacrylamide - 4X Tris-Cl/SDS, pH=6.8 - Tris Cl/SDS, pH=8.8 - 5X SDS/electrophoresis buffer - 2X SDS/sample buffer - 10% Amoni persulfat - TEMED 3. Cỏch tiến hành
Chuẩn bị đổ gel cú nồng độ 5% của Acrylamide.
Đổ gel lớp tỏch(gel tra protein), tỉ lệ theo bảng sau:[17]
30% acrylamide/0.8 bisacrylamide 2.5ml 4X Tris-Cl/SDS, pH=8.8 3.75ml Nước 8.75ml 10% amoni persulfat 0.05ml TEMED 0.01ml
Bước 1: Cho húa chất vào ống phalcon 15ml hoặc cốc thủy tinh, trộn đều dung dịch của lớp gel tỏch, dựng pipet hỳt và bơm dung dịch vào buồng gel khi lớp gel cỏch mộp trờn bản thủy tinh 1.5-2cm. Trong quỏ trỡnh đổ gel nờn trỏnh khụng để cho bọt khớ cũn lại trong lớp gel.
Bước 2: Phủ một lớp nước hoặc n-propanol lờn trờn bề mặt lớp gel vừa đổ để tạo đường phõn cỏch giữa hai lớp gel. Quỏ trỡnh polyme húa sẽ hoàn thành từ 1-3h.
Đổ gel lớp stacking ( lớp cụ đặc), tỉ lệ theo bảng:[17]
30%acrylamide/0.8 bisacrylamide 0.65ml
4X Tris-Cl/SDS, pH=6.8 1.25ml
Nước 3.05ml
10% amoni persulfat 25àl
TEMED 5àl
Hỡnh 6: Sơ đồ điện di protein trờn gel acrylamide
Bước 3: Khi lớp gel đó đụng hoàn toàn, hỳt bỏ lớp nước phớa trờn và đổ tiếp lớp Stacking gel lờn trờn cho tới khi đầy buồng gel đặt lược vào buồng sao cho khụng tạo bọt khớ dưới chõn lược tạo cỏc giếng tra mẫu, quỏ trỡnh polyme húa lớp gel này khoảng 30 phỳt.
Sau khi lớp gel thứ 2 đó đụng nhẹ nhàng gỡ lược ra khỏi bản gel và khuụn kớnh ra khỏi khung cố định rồi đặt khuụn kớnh đú vào thiết bị chạy điện di.
Chuẩn bị dung dịch chạy điện di: Dung dịch chạy điện di protein là dung dịch 1X SDS/ electrophoresis buffer
- Ta thờm nước cất vào dung dịch 5X SDS/electrophoresis buffer để tạo thành dung dịch 1X SDS/ electrophoresis buffer.
- Dung dịch nhuộm bản gel là 0.1% coomassie Blue R-250 được pha theo tỉ lệ Methanol: glacial acetic acid: nước =5:5:1
Bước 4: chạy điện di:
Đổ ngập dung dịch điện di 1XSDS/electrophoresis buffer lờn toàn bộ bản gel trong buồng điện di sao cho dung dịch ngập bản gel 1-2mm.
Mẫu protein: lấy 10àl protein, 5àl PBL, SDS 10% cho vào ống eppendoft cho mẫu vào nước núng 950C trong 5 phỳt để làm biến tớnh protein. Lấy mẫu tra lần lượt vào cỏc giếng trong bản gel rồi chạy điện di ở hiệu điện thế 130V đến khi mẫu chạy gần hết bản gel cỏch đỏy 1cm
Bước 5: Nhuộm bản gel:
Chạy điện di xong bản gel được nhuộm bằng dung dịch 0.1% coomassie Blue R-250 được lọc qua giấy whatman ở 500C trong thời gian 30 phỳt.
Bước 6: Tẩy màu:
Cho bản gel vào trong dung dịch chứa Methanol: nước ( tỉ lệ 45% : 55%) lắc nhẹ trong 30 phỳt rồi đổ dung dịch vừa rửa đi.
Pha dung dịch 5% (v/v) methanol, 7% (v/v) acid acetic, 88% (v/v) nước để loại bỏ màu. Cho bản gel vào lắc cho đến khi bản gel mất màu là được.
Bước 7: Tẩy màu bản gel xong bản gel được chuyển vào giấy lọc whatman sấy khụ ở 800C trong 80 phỳt hoặc scan hay chụp ảnh. Dựa vào kết quả chạy điện di protein này để đỏnh giỏ và phõn tớch biểu hiện gen.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phõn tớch trỡnh tự axit amin của gen gerF
Gen gerF mó húa cho enzyme dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3- epimerase. Kết quả giải trỡnh tự được thể hiện ở hỡnh và được so sỏnh bằng phần mền BLAST trờn địa chỉ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Trỡnh tự nucleotid thu được khi ta đem so sỏnh với trỡnh tự cỏc gen cú chức năng tương tự trờn ngõn hàng gen NBCI thỡ thấy trỡnh tự này tương đồng 100% với trỡnh tự nucleotid đó được cụng bố trờn ngõn hàng gen thế giớivới
mó số ABB52524.1 thuộc chủng streptomyces sp, KCTC
0041BPdihydrochalcomycin. Cú độ tương đồng 99% so với gen của chủng
streptomyces sp. Mg1 và cú độ tương đồng 96% so với gen của chủng
streptomyces bikiniensis (Hỡnh 7)
Hỡnh 7: So sỏnh trỡnh tự nucleotide gen gerF với trỡnh tự của một số gen cú chức năng dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3-epimerase trong ngõn hàng gen
thế giới NCBI.
Chỉ đỏnh giỏ về độ tương đồng về nucleotid thỡ chưa đủ, ta cần phải cú cỏc phõn tớch đỏnh giỏ về trỡnh tự axit amin và cấu trỳc enzyme này. Trỡnh tự nucleotid được chuyển thành trỡnh tự axit amin bằng phương phỏp sử dụng phần mềm BLAST so sỏnh với trỡnh tự axit amin đó được đăng ký trờn ngõn hàng gen thế giới, trỡnh tự axit amin khi giải trỡnh tự như sau: