NGUYÊN LIỆU – ĐỊA ĐIỂ M NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2.2. Xác định hàm lượng protein thô theo phương pháp Kjeldahl
Nguyên tắc:
Các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ dưới tác dụng của nhiệt độ cao và H2SO4 đậm đặc sẽ bị vô cơ hóa. Trong quá trình này các hợp chất hữu cơ sẽ bị phân giải và oxi hóa tạo thành CO2, SO2, H2O.
Nitơ giải phóng ra dưới dạng amoniac NH3 sẽ tạo ngay với H2SO4 đặc thành (NH4)2SO4:
NH3 + H2SO4 đặc (NH4)2SO4
Dùng kiềm để phân giải muối này, amoniac bay ra: (NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH4OH + Na2SO4
Thu nhận NH3 bằng dung dịch axit boric (H3BO3) ở nồng độ xác định 2,5%. Sau đó chuẩn độ bằng hệ chuẩn độ tương ứng H3BO3 – H2SO4.
* Hóa chất: H2SO4 đặc, hỗn hợp xúc tác: K2SO4/CuSO4 với tỷ lệ 3/1 hoặc HClO4, NaOH 30%; H2SO4 0,1N, H3BO3 2,5%.
Thuốc thử hỗn hợp (Taxiro): xanh metylen 0,1%; đỏ metyl 0,1% trong etanol 96o, sau đó trộn xanh metylen với đỏ metyl theo tỷ lệ 1/2
* Dụng cụ: Ống đong 100ml, 50ml, 10ml, bình định mức 100ml, cốc 250ml, 100ml, 50ml, bình tam giác 250ml, đũa thủy tinh, lọ đựng hóa chất.
* Thiết bị: Bộ MicroKjeldhal loại 6 bình cất. Tiến hành và tính kết quả
Giai đoạn 1: Vô cơ hóa mẫu nghiên cứu
* Xử lý mẫu: Có thể dùng mẫu tươi hoặc mẫu khô. Trường hợp dùng mẫu tươi, trước khi công phá nên cho 1ml cồn ethylic để dịch công phá đỡ bị sủi bọt. Mẫu khô cần được sấy khô xác định độ ẩm, tán nhỏ mịn, rây qua rây (0,1mm).
Tùy theo hàm lượng protein có trong mẫu nghiên cứu nhiều hay ít mà chọn cách lấy mẫu cho thích hợp. (Ta tiến hành làm thí nghiệm với mẫu khô).
Mẫu khô và giàu protein ta lấy mẫu 0,2g (trên cân phân tích). Cho vào bình Kjeldhal.
Sau khi cho mẫu vào bình Kjeldhal, thêm vài giọt nước cất không có nitơ (nước cất 2 lần) để thấm ướt mẫu nếu là bột khô và một lượng H2SO4 đậm đặc (cứ 0,1g mẫu khô cho 1ml H2SO4 đậm đặc). Đậy kín bình, để yên trong 30 phút, tránh gây ô nhiễm môi trường.
Đặt bình Kjeldhal nghiêng 45o trên hệ thống đốt mẫu trong tủ hốt (ta sử dụng bếp điện có hệ thống này, khi đó ta phải đặt tấm lưới amiang lên bếp để ổn định nhiệt độ). Đun nhẹ trong 30 phút, tăng dần nhiệt độ để dung dịch sôi đều, không nên nâng nhiệt độ quá cao (100oC) làm dung dịch trong bình bắn ra ngoài. Trong quá trình đun, dung dịch chuyển từ nàu đen sang màu nâu sẫm. Lấy ra để nguội. Thêm 3 – 4 giọt HClO4 nhằm xúc tác cho phản ứng vô cơ hóa diễn ra nhanh hơn. (Nếu không có HClO4 mà dùng hỗn hợp K2SO4/CuSO4 theo tỷ lệ 3:1 thì có thể có khoảng 100mg ngay từ đầu). Đun tiếp dung dịch chuyển sang màu nâu cánh gián đến màu vàng nhạt, cuối cùng được dung dịch trắng trong. Kết thúc giai đoạn vô cơ hóa.
* Pha loãng dung dịch vô cơ hóa: Để nguội bình Kjeldhal, sau đó chuyển sang bình định mức (100ml), dùng nước cất 2 lần tráng lại bình Kjeldhal và đưa dung dịch đến mức của bình (V), dung dịch này được sử dụng để cất amoniac. Giai đoạn 2: Cất amoniac: Tiến hành cất amoniac trên máy MicroKjeldhal Để xác định lượng nitơ trong dung dịch mẫu có thể sử dụng hệ chuẩn H3BO3 – H2SO4
*Xác định nitơ theo hệ chuẩn H3BO3 – H2SO4:
- Chuẩn bị bình tạo hơi (1): Đổ nước cất một lần vào bình cầu đáy bằng (khoảng 2/3 thể tích của bình là đủ), đun sôi nước trong bình, trước khi cho mẫu. - Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng (2). Cho 20ml H3BO3 2,5% vào bình tam giác V = 100 – 250ml, thêm 5 giọt chỉ thị màu Taxiro, dung dịch có màu tím đỏ. (Trong môi trường axit Taxiro có màu tím đỏ, còn ở môi trường kiềm có
màu xanh lá mạ). Đặt bình hứng sao cho đầu ra của ống sinh hàn ngập trong dung dịch H3BO3. Trong bình hứng, dung dịch H3BO3 tự phân ly.
H3BO3 HBO2 + H2O -Quá trình đưa mẫu vào bình sục và cất amoniac:
+ Ta sử dụng bộ cất gồm nhiều bình (6 bình) liền nhau. Mẫu sau khi công phá ở bình Kjeldhal cho 1 – 2 giọt chỉ thị Taxiro, cho tiếp NaOH bão hòa vào cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh là được. Lắp trực tiếp bình Kjeldhal vào máy. Dùng lắp đậy nối liền với ống sinh hàn và bình hứng, đậy chặt vào miệng các bình Kjeldhal đang chứa mẫu. Cuối cùng lắp kín bình lại, bắt đầu bật bếp để đun.
* Chuẩn độ: Xác định lượng BO2- bằng cách chuẩn độ ngược với H2SO4
0,1N khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ là được: BO2- + H+ HBO2
Song song bình thí nghiệm, tiến hành bình đối chứng. Làm tương tự như bình thí nghiệm, chỉ khác là không có mẫu, cũng đốt trong 30 phút và đem cất. Chuẩn độ.
* Tính kết quả:
Hàm lượng nitơ có trong nguyên liệu là:
100 42 , 1 / % × × × × = c v V a ml mg Nts Trong đó:
a: Lượng H2SO4 0,1N được dùng để chuẩn độ sau khi đã trừ ở bình đối chứng (ml).
c: Khối lượng mẫu đem phân tích (g).
1,42: Số mg nitơ tương đương với 1ml H2SO4 0,1N.