SẢN TRÊN THẾ GIỚI
Trên thế giới, các nghiên cứu phân tích dạng selen trong thủy, hải sản còn chưa nhiều và chủ yếu là nghiên cứu trong cá (thường là cá biển). Phương pháp thường được sử dụng để nghiên cứu phân tích là LC-ICP-MS.
Hầu hết các công bố về dạng selen được nghiên cứu đồng thời với dạng asen: Ruoh-Yun Wang và CCS [88] đã nghiên cứu xác định các dạng As (As(III), As(V), MMA, DMA, AsB, As-đường) và dạng Se (Se(IV), Se(VI)) trong các mẫu sinh học và môi trường bằng phương pháp IC-ICP-MS cho giới hạn phát hiện nằm trong khoảng 0,002-0,01 ng/ml (đối với các dạng As) và 0,01-0,02 ng/ml (đối với các dạng Se). Các tác giả đã áp dụng thành công vào phân tích hai mẫu cá (swordfish, DORM-2) và chỉ ra rằng khi dùng dung dịch metanol 80% (v/v) chiết mẫu ở 800C thì chiết được 99% các dạng As nhưng với dạng Se chỉ đạt được 35%. Chính vì lý do này mà kết quả tìm được chủ yếu là các dạng asen, cụ thể: đã tìm thấy các dạng As(III), As(V), MMA, DMA, AsB trong cả hai mẫu, đồng thời tìm thấy hai dạng Se(IV), Se(VI) trong mẫu cá kiếm (swordfish). X.C Le và CCS [63] đã xác định dạng AsB (đại diện cho các dạng As) và Se-Cyst (đại diện cho các dạng Se) trong cá ngừ bằng phương pháp HPLC-ICP-MS. Laura Hinojosa Reyes và CCS đã sử dụng phương pháp IC-ICP-MS để xác định đồng thời 5 dạng As (As(III), As(V), MMA, DMA, AsB) và ba dạng Se (SeMet, Se(IV), Se(VI)) trong mô cá, đạt được giới hạn phát hiện khoảng 0,1µg/l (đối với các dạng asen) và 0,7µg/l (đối với các dạng selen) [1]. G. Önning [89] đã phân lập các hợp chất Se hòa tan và xác định
hàm lượng của chúng trong các loại cá khác nhau bằng phương pháp sắc ký gel- GFAAS. B. Åkesson và CCS [90] cũng sử dụng phương pháp sắc ký gel kết hợp với GFAAS và HG-AAS để phân lập và xác định các hợp chất Se có trọng lượng phân tử thấp và cao trong cá.
1.6. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ DẠNG VẾT CÁC NGUYÊN TỐỞ VIỆT NAM
Cùng với nghiên cứu hoàn thiện, nâng cao và mở rộng phạm vi ứng dụng của các phương pháp phân tích hiện đại xác định nhạy, chính xác và chọn lọc cao vết các nguyên tố trong các mẫu phức tạp, từ vài chục năm lại đây, ở Việt Nam đã hình thành và phát triển hướng nghiên cứu xác định dạng vết nguyên tố trong nghiên cứu khoa học, công nghệ và môi trường. Đã có những công bố về nghiên cứu xác định dạng vết thủy ngân (Hg) và asen (As) trong các mẫu sinh học và môi trường [91,92]; nghiên cứu dạng vết asen trong một số loại mẫu môi trường biển [93-95]; nghiên cứu xác định hàm lượng và dạng tồn tại vết chì (Pb), cadimi (Cd), crom (Cr) và đồng (Cu) [74,96-98] trong mẫu đất trồng trọt, trong nước và trầm tích tự nhiên bằng các phương pháp Von-Ampe hòa tan và hấp thụ nguyên tử trong sự liên hợp với các phương pháp sắc ký, vừa có ý nghĩa khoa học, vừa có ý nghĩa thực tiễn phù hợp với phương hướng phát triển của phân tích học hiện đại, đáp ứng những yêu cầu ngày càng cao của khoa học, công nghệ và môi trường, nhưng chưa thấy có công trình nghiên cứu về phân tích dạng selen (Se) trong hải sản.
CHƯƠNG 2 - THỰC NGHIỆM 2.1. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
* Máy phân tích:
Việc ghi đo đường Von-Ampe hoà tan được thực hiện trên máy phân tích cực phổđa chức năng 797 VA computrace do hãng Metrohm (Thụy Sĩ) sản xuất.
- Hệđiện cực: gồm 3 điện cực:
•Điện cực làm việc (WE): Điện cực giọt treo thuỷ ngân (HMDE), là giọt thuỷ ngân có kích thước nhỏ, đường kính 0,05 ÷ 0,07 mm, treo trên một mao quản thuỷ tinh, điện cực này có ưu điểm: quá thế của hiđro lớn (môi trường axit -1,2V còn môi trường trung tính hay kiềm 1,5V). Trên bề mặt điện cực xảy ra quá trình làm giàu và hoà tan chất cần phân tích.
•Điện cực so sánh (RE): Ag⏐AgCl⏐Cl-, điện cực luôn được bảo quản trong dung dịch KCl 3M.
•Điện cực phù trợ (AE): Điện cực Pt.
- Bình điện phân: Dung tích 50ml, được chế tạo từ thủy tinh thạch anh. Nắp bình có gắn các điện cực, ống dẫn khí trơ (N2) nhằm đuổi ôxy hoà tan trong dung dịch ghi đo và có que khuấy từđể khuấy trộn dung dịch ghi đo.
Máy phân tích cực phổđa năng 797 VA Computrace (Metrohm)-Thụy Sĩ
* Máy vi tính HP dùng để điều khiển thiết bị ghi đo, ghi và xử lý kết quả. Mọi thông số ghi đo đều được nhập từ bàn phím.
* Máy đo pH (pH Meter HM 16S của Nhật Bản) * Máy cất nước 2 lần (UHQ-ELGA của Anh)
* Máy ly tâm (MISTRAL 1000, Galekamp của Đức) * Cân phân tích chính xác đến 0,01mg
* Bếp điện điều nhiệt có khuấy từ * Bình Kendan
* Các loại pipet (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml), micropipet (5 ÷ 50 µl, 50 ÷ 250 µl, 100 ÷ 500 µl). Bình định mức (5ml, 10 ml, 20 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml). Bình eclen, cốc đong, ống đong, phễu lọc, giấy lọc, … (các dụng cụ được rửa sạch bằng hỗn hợp rửa sunfocromic sau đó tráng lại nhiều lần bằng nước cất siêu sạch).
* Màng lọc 0,45 µm, Whatman, Nhật Bản.
2.1.2. Hoá chất
- Khí Nitơ 99,99%, Công ty Air Liquit
- Axít clohydric HCl nồng độ 37%, PA, Merck - Axít nitric HNO3 nồng độ 65%, PA, Merck - Axít sunfuric H2SO4 nồng độ 98%, PA, Merck - Axít pecloric HClO4 98%, PA, Merck
- Axit stearic ≥ 99%, PA, Merck - Natri hydrôxyt NaOH, PA, Merck - Etanol C2H5OH, PA, Merck - Diclometan CH2Cl2, PA, Merck
- Litipeclorat ngậm 5H2O: LiClO4.5H2O, Sigma-Aldrich
- Các loại hóa chất chuẩn dạng selen đều thuộc loại tinh khiết phân tích: + Se(IV) - Na2SeO3 - Natri selenit 99%, Sigma-Aldrich. + Se(VI) - Na2SeO4 - Natri selenat 99%, Sigma-Aldrich. + Se-Cyst - C6H12N2O4Se2 - Selencystin 99%, Sigma.
+ DMDSe - (CH3)2Se2 - Dimetyl diselenua 98% (d = 1,987), Sigma. - Các dung dịch chuẩn: Zn(II), Pb(II), Cu(II), Mn(II), Cd(II), Fe(III) dưới dạng muối nitrat, As(V) dưới dạng H3AsO4,... đều thuộc loại PA của Merck.
2.2. NỘI DUNG THỰC NGHIỆM 2.2.1. Pha các dung dịch chuẩn
- Se(IV) (nồng độ 1000mg/l): cân 1,376g Na2SeO3 cho vào bình định mức 1000 ml, thêm nước cất siêu sạch, lắc cho tan hết và định mức bằng nước cất siêu sạch đến vạch.
- Se(VI) (nồng độ 1000mg/l): cân 1,32g Na2SeO4 cho vào bình định mức 1000 ml đã có sẵn 0,35ml HNO3 đặc (d = 1,4) trong nước cất siêu sạch, lắc cho tan hết và định mức bằng nước cất siêu sạch đến vạch.
- Se-Cyst (nồng độ 1000mg/l): cân 0,101g Se-Cyst cho vào bình định mức 100ml, thêm vào dung dịch HCl 0,1M, lắc cho tan hết và định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 0,1M, dung dịch được bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh.
- DMDSe (nồng độ 1000mg/l): hút 51,3µl (tức 0,102g) DMDSe cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng dung môi etanol. Dung dịch được bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh.
- LiClO4 2M/etanol : cân 3,2g LiClO4.5H2O cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng dung môi etanol. Dung dịch được sử dụng trong ngày.
- Axít stearic 1000mg/l: cân 0,1g axít stearic cho vào bình định mức 100ml, thêm etanol vào và lắc cho tan hết, tiếp tục định mức bằng etanol cho đến vạch.
- Các dung dịch chuẩn: Cu(II), Pb(II), Zn(II), Cd(II), Fe(III), As(V),... (nồng độ 1000mg/l) được pha từ dung dịch chuẩn của Merck bằng nước cất siêu sạch.
- Các dung dịch làm việc được pha loãng hàng ngày từ dung dịch đặc 1000mg/l bằng nước cất siêu sạch, riêng DMDSe và axít stearic được pha loãng bằng dung môi etanol.
2.2.2. Chuẩn bị mẫu phân tích
Lấy mẫu:
Với mục đích nghiên cứu xác định hàm lượng tổng và dạng selen trong mẫu hải sản, chúng tôi đặt mua mẫu hải sản còn tươi (các mẫu cá, tôm sú, ngao) với lượng vừa đủ cho việc phân tích định lượng.
Gia công mẫu [99,100]:
Để giữ nguyên các dạng ban đầu của selen, hải sản phải còn tươi, sau đó rửa sạch và chuẩn bị mẫu theo cấu tạo của từng loại, sao cho chỉ cần thu phần ăn được.
Cụ thể:
- Tôm: bóc vỏ, chỉ lấy phần thịt, cắt nhỏ - Cá: cắt đầu, làm vẩy, bỏ ruột, cắt nhỏ
- Ngao: bỏ vỏ, lấy phần thân ra và bỏ phân đi chỉ lấy phần ăn được
Bảo quản mẫu [99,100]:
Tất cả những phần mẫu thu được đem khô đông (lyophilisation) ở -24oC trong thời gian 72h. Mẫu tiếp tục được nghiền nhỏ, trộn đều, đóng gói và bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh.
2.2.3. Các bước nghiên cứu để xây dựng quy trình phân tích bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan pháp Von-Ampe hòa tan
2.2.3.1. Nghiên cứu các điều kiện phân tích tối ưu
a. Nghiên cứu chọn dung dịch nền điện li
Dung dịch nền điện li là một yếu tố quan trọng trong phương pháp phân tích Von-Ampe hòa tan, quyết định đến độ dẫn điện của dung dịch phân tích, ảnh hưởng đến sự tồn tại của các ion, các chất cần phân tích và do đó ảnh hưởng đến cường độ dòng pic hòa tan và thếđỉnh pic.
Để lựa chọn dung dịch nền điện li, chúng tôi tiến hành theo các bước sau: - Nghiên cứu chọn dung dịch điện li: dung dịch điện li phải là dung dịch mà ởđó chất cần phân tích cho tín hiệu Ip cao, chân pic thấp và pic cân đối.
- Nghiên cứu nồng độ dung dịch điện li: thay đổi nồng độ dung dịch điện li trong một khoảng rộng và lựa chọn vùng nồng độ mà tại đó chất cần phân tích cho Ipổn định, cao và cân đối.
b. Nghiên cứu chọn các thông số kỹ thuật ghi đo tối ưu
Các thông số kỹ thuật ghi đo ảnh hưởng đến độ lớn của cường độ dòng pic cũng như thế đỉnh pic và độ phân giải của đỉnh pic. Để nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số này, chúng tôi thay đổi các giá trị thông số ghi đo trong một khoảng thích hợp và ghi đo pic tương ứng. Tổng hợp các giá trị Ip ghi đo được và lựa chọn thông số ghi đo tối ưu là thông số mà tại đó Ipđạt giá trị cao và pic cân đối.
Các thông số kỹ thuật ghi đo được nghiên cứu lần lượt như sau: - Nghiên cứu thếđiện phân làm giàu
- Nghiên cứu thời gian điện phân làm giàu - Nghiên cứu tốc độ quét thế
- Nghiên cứu biên độ xung - Nghiên cứu thời gian đặt xung - Nghiên cứu tốc độ khuấy dung dịch - Nghiên cứu kích thước giọt Hg - Nghiên cứu thời gian cân bằng
- Nghiên cứu thời gian sục khí N2 (đuổi ôxy hòa tan trong dung dịch)
2.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion, các chất đến phép ghi đo chất cần phân tích
Chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại có thể tồn tại trong mẫu nghiên cứu mà có thếđỉnh pic gần với thếđỉnh pic của chất cần phân tích hoặc thường có mặt nhiều trong các mẫu môi trường. Bằng cách ghi đo Ip của chất cần phân tích khi không thêm và khi thêm các ion nghiên cứu sựảnh hưởng, chúng tôi tính toán được tỉ lệ giữa chúng và tìm ra giá trị mà ởđó Ip của chất cần phân tích bắt đầu có sự thay đổi (tăng hoặc giảm) khoảng 10%.
2.2.3.3. Xây dựng đường chuẩn.
- Để xác định hàm lượng chất phân tích trong mẫu, người ta thường xây dựng phương trình đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của I và C có dạng:
I = k.C
- Chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn của các chất cần phân tích ở hai vùng nồng độ (0,08 ÷ 1) ppb và (0,8 ÷ 10) ppb đối với Se(IV); (0,5 ÷ 8) ppb và (5 ÷ 45) ppb đối với Se-Cyst và vùng nồng độ (2 ÷ 22) ppb đối với DMDSe.
2.2.3.4. Đánh giá độ tin cậy, độ chính xác của phương pháp
Tiến hành đánh giá phương pháp dựa trên nghiên cứu độ lặp lại, tính toán giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp.
sánh kết quả phân tích mẫu với phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò graphit (GFAAS) và phân tích mẫu chuẩn Quốc tế.
2.2.3.5. Xây dựng quy trình phân tích và áp dụng đểđịnh lượng hàm lượng tổng và một số dạng selen trong mẫu hải sản
- Trên cơ sở tham khảo các tài liệu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện phân tích tối ưu, từđó đưa ra quy trình phân tích tổng và dạng selen trong hải sản. - Áp dụng quy trình phân tích đã nghiên cứu, thiết lập để xác định hàm lượng tổng và dạng của selen
- Đánh giá quy trình phân tích thông qua nghiên cứu độ thu hồi, hiệu suất chiết
2.2.4. Xử lí số liệu thực nghiệm
Các số liệu thực nghiệm được xử lí theo phương pháp thống kê toán học. - Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua các đại lượng thống kê như độ lệch chuẩn S, độ lệch chuẩn trung bình Sx, hệ số biến động V khi tiến hành 10 phép ghi đo liên tục đối với cùng một dung dịch ghi đo [101,102].
+ Độ lệch chuẩn S: + Độ lệch chuẩn trung bình: + Hệ số biến động: % 100 . X S v = Trong đó:
Xi: giá trị ghi đo được thứ i X: giá trị trung bình
N: số lần thực nghiệm
(2.1)
(2.2)
- Kiểm tra thống kê các dữ kiện thực nghiệm [101,102,103]:
+ Khi số thí nghiệm nhỏ hơn 10 (n<10), để kiểm tra các dữ kiện nghi ngờ, loại bỏ các giá trị mắc sai số thô, chúng tôi dùng chuẩn Đisơn (Q).
+ Đểđánh giá mức độ sai khác giữa kết quả phân tích mẫu chuẩn với giá trị chứng chỉ xem có chấp nhận được không, chúng tôi dùng chuẩn student (t).
+ Khi so sánh kết quả phân tích theo phương pháp đã xây dựng được với kết quả phân tích theo phương pháp khác, chúng tôi dùng chuẩn Fisơ (F).
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp được tính theo quy tắc phổ biến 3σ [85,103,104].
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích có thể tạo ra được tín hiệu có khả năng phân biệt một cách tin cậy với tín hiệu mẫu trắng (hay tín hiệu nền). Có nhiều quan điểm khác nhau về cách xác định giới hạn phát hiện, phổ biến nhất là cách xác định giới hạn phát hiện theo quy tắc 3σ. Theo quy tắc này, LOD được quy ước là nồng độ của chất nghiên cứu cho tín hiệu cao gấp 3 lần độ lệch chuẩn của đường nền.
Cách xác định LOD: ghi đo lặp lại 10 lần đối với mỗi dung dịch Se(IV), Se- Cyst, DMDSe có nồng độ xác định trong điều kiện tối ưu đã đưa ra, chấp nhận sự sai khác giữa độ lệch chuẩn của phép ghi đo và độ lệch chuẩn của đường nền là không đáng kể. Nếu nồng độ chất trong mẫu là C thì giới hạn phát hiện tính theo quy tắc 3σ là:
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được và có ý nghĩa định lượng so với tín hiệu của mẫu trắng (hay tín hiệu nền). Thông thường, giới hạn định lượng được tính theo công thức sau:
(2.4)
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐIỆN HÓA CỦA SELEN TRÊN HMDE
Trong 1.2, chúng tôi đã trình bày vắn tắt về tính chất điện hóa của selen và rút ra kết luận: một số dạng vô cơ, hữu cơ của selen như Se(IV), Se-Cyst và DMDSe có hoạt tính điện hóa. Trong phần này, chúng tôi tiến hành ghi đo các đường Von-Ampe vòng nghiên cứu tính chất điện hóa của các dạng selen kể trên trên HMDE.
3.1.1. Nghiên cứu đặc tính Von-Ampe vòng của Se(IV)
Đã tiến hành ghi đo đường CV của Se(IV) trong nền HCl 0,1M, kết quả thu được ở hình 3.1.
Hình 3.1: Đường CV của 200ppb Se(IV) trên nền HCl 0,1M
Khoảng thế quét (+0,1 ÷ -1,0)V, tốc độ quét 50mV/s.
3.1.2. Nghiên cứu đặc tính Von-Ampe vòng của Se-Cyst
Đã tiến hành ghi đo đường CV của Se-Cyst trong nền HCl 0,1M, kết quả thu được ở hình 3.2.
Hình 3.2: Đường CV của 700ppb Se-Cyst trên nền HCl 0,1M
Khoảng thế quét (+0,1 ÷ -0,8)V, tốc độ quét 50mV/s
3.1.3. Nghiên cứu đặc tính Von-Ampe vòng của DMDSe
Đã tiến hành ghi đo đường CV của DMDSe trong pha hữu cơ (CH2Cl2+C2H5OH)