Áp dụng theo TCVN 6846: 2007, ISO 7251: 2006 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng E. coli giả định - Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất [3].
3.4.5.1. Nguyên tắc
Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ kế tiếp nhau cách nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 ống. Theo dõi sự sinh hơi trong ống nghiệm. Xác định ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng sau khi nuôi cấy vào các ống canh thang Escherichia coli Broth (canh thang EC) ở 440C/ 24 -
48 giờ, cho thử nghiệm sinh Indol dương tính và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g hay 1 ml ban đầu.
3.4.5.2. Môi trường sử dụng
− Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn E. coli là môi trường
canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ kép và canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ đơn được đóng sẵn dạng bột tryptoza lauryl sunfat (hãng MERCK của nước Đức). Khi sử dụng được pha theo công thức.
+ Canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ kép được pha chế theo tỷ lệ 71,2g lauryl sunfat trong 1000ml nước cất.
+ Canh thang tryptoza lauryl sunfat nông độ đơn được pha chế theo tỷ lệ 35,6g lauryl sunfat trong 1000ml nước cất.
− Môi trường cấy chuyển E. coli là môi trường canh thang EC. Thành phần gồm:
+ Lactoza: 5g
+ Muối mật (bile salt): 1,5g + NaCl: 5g
+ Dịch thủy phân casein bằng enzyme: 20g
+ K2HPO4: 4g + KH2PO4: 1,5g + Nước cất: 1000ml
− Dung dịch pha loãng mẫu (dung dịch đệm pepton BPW). Thành phần gồm:
+ Nước cất 1000ml + Pepton wasser 25,5g
− Môi trường nuôi cấy, canh thang EC, nước pha loãng được chế biến theo công thức. Các môi trường được đun sôi hòa tan hoàn toàn, hấp tiệt trùng (1100C), để nguội, sau đó được đóng sẵn vào bình cầu, bỡnh nún, ống nghiệm. Bảo quản ở nhiệt độ 40C.
3.4.5.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
− Hút chính xác 25ml mẫu đã được chuẩn bị cho vào bỡnh nún chứa sẵn 225ml nước muối đệm pepton (BPW). Lắc đều trong 2 phút. Thu được huyền phù ban đầu 10-1.
− Dùng pipet vô trùng hút 10ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa sẵn 90ml dung dịch BPW, lắc đều. Thu được dung dịch pha loãng 10-2, tiếp tục như vậy ta thu được các dung dịch mẫu 10-3, 10-4…
3.4.5.4. Các bước tiến hành:
− Nuôi cấy mẫu
+ Đối với độ pha loãng 10-1: Dùng pipet vô trùng chuyển vào bộ ba ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc canh thang tryptoza laury sunfat nồng độ kép 10ml mẫu thử. Sau đó dùng pipet vô trùng chuyển vào bộ ba ống nghiệm chứa canh thang tryptoza laury sunfat nồng độ đơn 1ml mẫu thử.
+ Đối với nồng độ pha loãng tiếp theo, dùng pipet vô trùng chuyển vào mỗi ống bộ ba ống nghiệm chứa canh thang tryptoza laury sunfat nồng độ đơn 1ml mẫu thử.
+ Để ống canh thang trên vào trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C/ 24h (nếu giai đoạn này không sinh khí, và mờ đục môi trường thì ủ tiếp đến 48h
+ Đọc các ống dương tính: Làm đục canh thang và sinh hơi. − Cấy chuyển khẳng định
+ Cấy chuyển và ủ môi trường chọn lọc (canh thang EC): Từ các ống dương tính trờn, dựng que cấy vô trùng cấy chuyển sang những ống môi trường canh thang EC, mỗi ống 1 vòng cấy. Ủ ấm 440C/ 24 - 48h. Xác định và ghi lại ống dương tính ở từng độ pha loãng: Đục canh thang, sinh hơi.
+ Cấy và ủ môi trường nước pepton: từ những ống dương tính trên, cấy vào ống nghiệm đựng nước pepton đã được làm ấm đến 440C một vòng dịch cấy. Ủ trong tủ ấm 440C/ 24 - 48h.
− Kiểm tra tính sinh indol
Từ những ống dương tính ở bước trờn, thờm 0,5ml thuốc thử Kovas vào mỗi ống, trộn kỹ và kiểm tra sau 1 phút. Nếu trong ống nghiệm xuất hiện một vòng nhẫn màu đỏ chứng tỏ có mặt indol, nếu không có mặt indol trong ống nghiệm chỉ xuất hiện một vòng nhẫn màu vàng.
3.4.5.5. Tính kết quả:
− Đếm số ống dương tính của môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn và môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép
− Từ những ống dương tính, tra bảng MPN để xác định tổng số E. coli giả định có trong 1g hoặc 1ml mẫu thử.
Hình 3.1:Sơ đồ kiểm nghiệm C. perfringens, Coliform, E. coli trong thực phẩmĐồng nh t v pha loãng m u 10ấ à-1, 10-2, 10-3,… ẫ C y v o ng tryptoza lauryl sunfat, m i n ng ấ à ố ỗ ồ độ
3 ng l p l i, 37ố ặ ạ ủ 0C/24 giờ
Ghi nh n các ng (+) m i n ng pha loãngậ ố ở ỗ ồ độ
C y v o ng th ch Wilson ấ à ố ạ
Blair, m i n ng 2 ng ỗ ồ độ ố
l p l i, m i ng thêm 2ml ặ ạ ỗ ố
3.4.6. Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hoá học của vi khuẩn E.coli
3.4.6.1. Xác định đặc tính nuôi cấy E. coli trên môi trường Macconkey
− Môi trường MacConkey dùng để xác định hình thái khuẩn lạc E. coli. Môi trường MacConkey được đóng sẵn ở dạng bột MacConkey (hãng MERCK của nước Đức), khi sử dụng pha theo công thức: Cân 50 gam môi trường vào 1000ml nước cất, đun sôi hòa tan các chất. Hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Sau đó đổ ra các hộp lồng trong buồng cấy vô trùng, bật tia cức tím trong 15 phút. Bảo quản ở nhiệt độ 40C [11].
− Các bước tiến hành: Từ những ống canh thang EC xác định dương tính với E. coli, ta dùng que cấy lấy một vòng cấy, cấy theo đường ziczac trên bề mặt thạch, sau đó ủ ở 370C.
− Kết quả: Sau 24h nuôi cấy, nếu môi trường có sự xuất hiện vi khuẩn E.
coli trên đĩa thạch sẽ hình thành những khuẩn lạc màu hồng cánh sen, tròn,
gọn, nhẵn, hơi lồi.
3.4.6.2. Xác định đặc tính nuôi cấy E. coli trên môi trường Endo
− Môi trường Endo để xác định hình thái khuẩn lạc E. coli. Môi trường Endo được đóng sẵn ở dạng bột Endo (hãng MERCK của nước Đức), khi sử dụng pha theo công thức: Cân 7,8g Endo hòa với 200ml nước cất, đun sôi cho hòa tan các chất, chuẩn pH = 7,6. Hấp ở 1100C/15 phút, sau đó rót ra hộp lồng trong buồng cấy vô trùng, bật tia cực tím trong 15 phút. Bảo quản ở 40C.
− Các bước tiến hành: Dùng que cấy lấy một khuẩn lạc trên môi trường MacConkey, cấy theo đường ziczac trên bề mặt thạch, sau đó ủ ở 370C. Sau 24giờ nuôi cấy, trên đĩa thạch sẽ hình thành khuẩn lạc màu đỏ ánh kim.
3.4.6.3. Xác định đặc tính E. coli trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar)
− Môi trường KIA được sử dụng để kết hợp thử nghiệm đồng thời khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S. Thành phần gồm:
pha loãng, tra b ng MPNả độ pha loãng
Coliform C y v o ng ch a n c ấ à ố ứ ướ pepton, ủ440C/ 48h Th nghi m Indolử ệ m s canh EC (+) v Đế ố à Indo (+), tra b ng MPNả E. coli C. perfringens m s khu n l c, Đế ố ẩ ạ tính k t quế ả
+Cao thịt : 3g +Cao men: 3g +Pepton: 20g +NaCl: 5g
+ Ferric ammonium citrate: 0,5 g +Dung dich phenol đỏ 0,5%: 6ml
+ Glucose 1g
+ Natri thiosunfat: 0,5g + Lactose: 10g
+ Thạch 12g
+ Nước cất 1000ml
− Chuẩn bị môi trường: Cho thạch vào nước đun sôi khuấy liên tục cho tan hoàn toàn, thờm cỏc hóa chất còn lại, điều chỉnh pH = 7,4, sau cùng thêm 6ml dung dịch phenol đỏ 0,5%. Hấp 1210C trong 15 phút. Làm ống thạch nghiêng, bảo quản ở nhiệt độ 40C [11].
− Các bước tiến hành: Dùng que cấy vô trùng chọn các khuẩn lạc đặc trưng cấy lên môi trường KIA. Đưa que cấy sâu thẳng dưới đáy ống nghiệm, phần thạch nghiêng phía trên cấy theo đường ziczac, ủ trong tủ ấm ở 370C trong 18 - 24 giờ. Sau đó mang ra quan sát và đọc kết quả.
− Đọc kết quả:
+ Phản ứng lên men đường: Phần thạch nghiêng: Sau khi cấy 24 giờ môi trường chuyển màu vàng chanh là do lên men đường lactose. Phần thạch đứng: Sau khi cấy 24 giờ môi trường chuyển màu vàng chanh là do lên men đường glucose. Phản ứng dương tính là khi môi trường chuyển sang màu vàng do làm giảm pH môi trường, âm tính khi không chuyển màu [8].
+ Phản ứng sinh hơi: Sau 24giờ nuôi cấy ở 370C, phần thạch đứng bị vỡ hoặc bị đẩy lên là dương tính (+), ngược lại là âm tính (-). Do vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose trong điều kiện yếm khí để sinh trưởng, đẩy môi trường lên phía trên.
+ Phản ứng sinh H2S: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C nếu phần thạch đứng chuyển sang màu đen là phản ứng dương tính (+), không tạo màu đen là phản ứng âm tính (-) [13].
3.4.6.4. Xác định đặc tính E. coli vtrờn môi trường Urea Indol
− Môi trường Urea Indol dùng để xác định vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme urease xúc tác thủy phân urea và khả năng sinh indol sau khi nhỏ thuốc thử Kovac’s.
− Thành phần môi trường Ure Indol gồm: + L-Tryptophan : 3g
+ KH2PO4: 1g + K2PO4: 1g
+ Dung dịch phenol đỏ trong cồn: 2ml
+NaCl: 5g +Urea: 20g
+Nước cất: 1000ml − Chuẩn bị môi trường: Đun sôi hòa tan các chất ở 50 – 600C, điều chỉnh pH = 7,2, sau cùng cho dung dịch phenol đỏ. Đong vào ống nghiệm, mỗi ống 1 - 2ml, khử khuẩn ở lò hấp 750C/ 1giờ.
− Các bước tiến hành: Dùng que cấy vô trùng chọn các khuẩn lạc đặc trưng cấy vào môi trường Urea Indol. Ủ trong tủ ấm ở 370C sau 18 - 24 giờ mang ra quan sát và đọc kết quả.
− Đọc kết quả:
+ Sau 24 giờ nuôi cấy, nếu màu của môi trường chuyển từ màu đỏ da cam sang màu đỏ cánh sen thì khẳng định Urea (+), do vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme urease xúc tác sự thủy phân của urea phóng thích ra NH3 và CO2 làm tăng pH môi trường, ngược lại nếu môi trường không đổi màu thì Urea (-) [11].
+ Sau đó nhỏ 2 giọt thuốc thử Kovac’s, nếu xuất hiện vòng nhẫn màu đỏ trên bề mặt môi trường thì đó là phản ứng sinh Indol (+) [8].
3.4.6.5. Xác định đặc tính E. coli trên môi trường Mannitol di động
− Môi trường Mannitol di động dùng để xác định khả năng di động và sử dụng đường mannitol của vi khuẩn. Thành phần môi trường gồm:
+ Dung dịch phenol đỏ1%: 2ml + Pep ton: 20g + KNO3: 1g +Mannitol: 10g +Thạch: 4g +Nước cất: 1000ml
− Chuẩn bị môi trường: Đun sôi hòa tan các chất, điều chỉnh pH = 7,6. Sau cùng cho dung dịch phenol đỏ, sau đó đong vào các ống nghiệm, hấp khử khuẩn ở 1100C/ 3 phút.
− Các bước tiến hành: Dùng que cấy vô trùng chọn các khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào môi trường Mannitol di động. Đưa que cấy cắm thẳng xuống
dưới đáy ống nghiệm. Ủ trong tủ ấm ở 370C sau 18 - 24 giờ mang ra quan sát và đọc kết quả.
− Đọc kết quả: Sau 24 giờ, nếu vi khuẩn có khả năng phân giải đường mannitol thì môi trường sẽ bị axit hóa, do đó môi trường sẽ chuyển từ đỏ sang vàng. Thử nghiệm tính di động là (+) khi vi khuẩn E. coli mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh, là (-) khi vi khuẩn chỉ mọc dọc theo đường cấy, trong khi môi trường xung quanh vẫn trong [13].
3.4.6.6. Nhuộm Gram vi khuẩn
Nhuộm Gram vi khuẩn nhằm xác định hình thái và tính chất bắt màu thuốc nhuộm của vi khuẩn E. coli và C. perfringens. Gồm các bước:
− Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nước cất vô trùng đặt vào giữa phiến kính. Lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ khuẩn lạc, dàn mỏng với nước cất trên phiến kính. Để dịch khuẩn tự khô hoàn toàn. Sau đó hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 đến 3 lần (không để tiêu bản quỏ núng).
− Nhỏ 1 giọt dung dịch Cristal violet lên lam kính để lưu lại trong thời gian 1 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất.
− Cố định màu vi khuẩn bằng cách phủ dung dịch lugol lên lam kính trong thời gian 1 phỳt rồớ rửa lại bằng nước cất.
− Cầm một đầu lam kính, nhỏ từ từ dung dịch tẩy màu (bằng cồn Axeton) cho đến khi vùng phiến kính bạc màu đi (thời gian tẩy cồn thường trong vòng 15 - 20 giây). Sau đó rửa lại bằng nước cất.
− Nhỏ 1 giọt dung dịch Safanin (hoặc fuchsin) lên lam kính trong thời gian 1 phút. Sau đó rửa sạch bằng nước cất. Dùng giấy thấm để thấm khô hoặc để khô tự nhiên.
− Quan sát hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu 100. Sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram (-) sẽ bắt màu hồng, vi khuẩn Gram (+)sẽ bắt màu tím [6].