Áp dụng theo TCVN 499:89 (ISO 7937:1985) - Vi sinh vật học. Hướng dẫn chung đếm Clostridium perfringens - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc bằng phương pháp ống thạch [1].
3.4.3.1. Nguyên tắc:
Vi khuẩn C. perfringens nuôi cấy trong môi trường thạch Wilson Blair ở 370C, trong điều kiện kị khí sau 24 giờ sẽ phát triển thành các khuẩn lạc có màu đen, tròn lồi.
3.4.3.2. Môi trường sử dụng
− Dung dịch đệm pepton BPW. Thành phần gồm: + Nước cất 1000ml
+ Pepton wasser 25,5g
− Môi trường nuôi cấy khẳng định C. perfringens là môi trường thạch Wilson Blair, pH 7,2 - 7,4. Thành phần môi trường gồm các hóa chất thuộc hãng MERCK của nước Đức, được pha theo công thức:
+ Nước cất 200ml + Cao thịt 1g + NaCl 1g + Thạch bột 4g + Pepton 2g + Glucoza 4g
Đun sôi hòa tan các chất, thử độ pH = 7,2 - 7,4, sau đó rót vào ống khuẩn tà, mỗi ống chứa 20 - 30ml môi trường. Hấp ở 1100C/ 30 phút, nếu chưa dùng ngay phải bảo quản trong tủ lạnh 0 - 40C.
3.4.3.3. Chuẩn dung dịch mẫu thử
− Hút chính xác 25ml thực phẩm đã được chuẩn bị cho vào bỡnh nún chứa sẵn 225ml nước muối đệm pepton (BPW).
− Lắc đều 2 - 3 phút. Thu được dung dịch mẫu thử 10-1
− Hút chính xác 10ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 90ml nước muối đệm pepton. Lắc đều trong 2 - 3 phút. Thu được dung dịch 10-2. Tiếp theo làm như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-2, 10-3, 10-4…
3.4.3.4. Các bước tiến hành:
− Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử như ở trên, tùy theo mức độ sạch, bẩn của mẫu mà pha loãng đến đậm độ dùng nuôi cấy.
− Đun ống thạch Wilson Blair để tan chảy thạch, để nguội khoảng 500C, cho vào thạch 10ml dung dịch mẫu thử, lắc đều. Mỗi nồng độ cấy 2 ống. Mỗi
ống cho thêm 2ml dung dịch Na2SO3 20% và 5 giọt phèn sắt 5%. Lắc trộn đều để cho các chất hòa đểu vào trong thạch. Các bước phải thực hiện nhanh chóng để thạch không kịp đông trở lại.
− Đun ống thạch trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 75 0C trong 15 phút nhằm mục đích tạo môi trường kị khí cho vi khuẩn C. perfringens phát triển, sau đó cần làm nguội nhanh.
− Ủ trong tủ ấm 37 0C/ 18 - 24h.
3.4.3.5. Tính kết quả:
− Quan sát trong ống thạch xuất hiện những khuẩn lạc C. perfringens có màu đen, đường kính ≥ 3mm.
− Tổng số vi khuẩn có trong 1ml mẫu được tính bằng cách lấy trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ có trong hai ống nghiệm nuôi cấy cùng nồng độ nhân với hệ số pha loãng tương ứng và chia cho 10.