Áp dụng theo TCVN 4882:2007, ISO 483:2006 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Coliform -
Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất [2].
3.4.4.1. Nguyên tắc:
Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ kế tiếp nhau cách nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 ống. Theo dõi sự sinh hơi và làm đục màu môi trường trong ống nghiệm. Xác định ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng sau khi nuôi cấy vào các ống canh thang Brilliant Green Bile Lactose Broth ở 370C/ 24 - 48 giờ và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g hay 1 ml ban đầu.
3.4.4.2. Chuẩn bị hóa chất
− Dung dịch pha loãng mẫu là dung dịch đệm pepton BPW. Thành phần gồm: + Nước cất 1000ml
− Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Coliform là môi trường canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ kép và canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ đơn, được đóng sẵn dạng bột (hãng MERCK). Khi sử dụng pha theo công thức:
+ Canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ kép được pha chế theo tỷ lệ 71,2 g lauryl sunfat trong 1000ml nước cất.
+ Canh thang tryptoza lauryl sunfat nông độ đơn được pha chế theo tỷ lệ 35,6g lauryl sunfat trong 1000ml nước cất.
− Môi trường cấy chuyển Coliform là môi trường canh thang xanh brilliant lactose mật bò (Brilliant Green Bile Lactose Broth – BGBL).
Thành phần gồm: + Pepton 10g + Lactose 10g + Mật bò 20g + Brilliant green 0,0133g + Nước cất 1000ml
− Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng được chế biến theo công thức chỉnh pH = 7,4. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bỡnh nún, ống nghiệm được hấp tiệt trùng (110 0C).
3.4.4.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử:
− Hút chính xác 25ml mẫu cho vào bình nón chứa 225ml nước muối đệm pepton (BPW). Lắc đều trong 2 phút. Thu được huyền phù ban đầu 10-1.
− Dùng pipet vô trùng hút 10ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa sẵn 90ml dung dịch BPW, lắc đều. Thu được dung dịch pha loãng 10-2, tiếp tục như vậy ta thu được các dung dịch mẫu 10-3, 10-4…
3.4.4.4. Các bước tiến hành:
− Nuôi cấy mẫu
+ Đối với độ pha loãng 10-1: Dùng pipet vô trùng chuyển vào bộ ba ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc canh thang tryptoza laury
sunfat nồng độ kép 10ml mẫu thử. Sau đó dùng pipet vô trùng chuyển vào bộ ba ống nghiệm chứa 9ml canh thang tryptoza laury sunfat nồng độ đơn 1ml mẫu thử.
+ Đối với nồng độ pha loãng tiếp theo, dùng pipet vô trùng chuyển vào mỗi ống bộ ba ống nghiệm chứa 9ml canh thang tryptoza laury sunfat nồng độ đơn1ml mẫu thử.
+ Để ống canh thanh trên vào trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C/ 24h (nếu giai đoạn này không sinh khí , và mờ đục môi trường thì ủ tiếp đến 48h)
+ Đọc các ống dương tính : làm đục canh thang và sinh hơi. − Cấy chuyển khẳng định
+ Từ các ống dương tính trờn, dựng que cấy vô trùng cấy chuyển tương ứng canh trùng sang những ống môi trường thử khẳng định (canh thang mật lactoza lục sáng ).
+ Ủ trong tủ ấm 370C/ 24h.
3.4.4.5. Tính kết quả:
− Xác định và ghi lại số ống dương tính ở từng độ pha loãng: Đục canh thang, sinh hơi, và chuyển màu canh thang từ xanh đậm sang xanh nhạt.
− Từ những ống dương tính, tra bảng MPN để xác định tổng số Coliform có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm.