Trên thế giới, có rất nhiều loại thực phẩm giống với tương Bần của Việt Nam, đó là các thực phẩm được sản xuất từ đỗ tương lên men, được làm gia vị và nước chấm trong nhiều món ăn, được đánh giá là loại thực phẩm có lợi cho sức khỏe và có nhiều đề tài khoa học nghiên cứu về thực trạng nhiễm vi sinh vật trong những loại thực phẩm này.
M. J. R. Nout , D. Bakshi và P. K. Sarkar nghiên cứu vi sinh vật an toàn trong Kinema, đây là một loại đậu nành lên men truyền thống của Nhật Bản và cỏc vựng đồi núi của Ấn Độ. Tác giả sử dụng đối tượng là 15 mẫu Kinema thương mại để xét nghiệm sự nhiễm khuẩn, bằng bộ kit chẩn đoán phát hiện độc tố của vi khuẩn trong thực phẩm. Kết quả trong tổng số 15 mẫu, Bacillus cereus có mặt trong 5 mẫu với số lượng vượt quá 104 CFU/g, Enterobacteriaceae và vi khuẩn Coliform vượt quá 105 CFU/g ở 10 mẫu. Escherichia coli trên 105 CFU/g đã được tìm thấy trong hai mẫu. Staphylococcus aureus không được phát hiện trong bất kỳ của các mẫu thử nghiệm. Tác giả kết luận rằng cách làm truyền thống của Kinema và sử dụng nó trong nấu món cà ri là an toàn. Tuy
nhiên, đối với cỏc mún khỏc khi sử dụng Kinema (không qua xử lý nhiệt) biện pháp phòng ngừa an toàn cũng phải chú trọng [21].
Nhóm tác giả Hsien-Feng Kung, Yung-Hsiang Tsai và Cheng-I Wei nghiên cứu về sự nhiễm khuẩn vi sinh vật trong Miso, đây là một loại thực phẩm được sản xuất rất giống với món tương Bần của Việt Nam, nguyên liệu chủ yếu cũng là đỗ tương, gạo, muối, thêm một phần lúa mạch được trộn đều và ủ lên men. Tuy nhiên Miso chủ yếu được sản xuất theo quy mô công nghiệp ớt cũn thấy làm tại gia đình. Chính vì vậy về mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm được chú trọng hơn. Tác giả thu thập 27 mẫu Miso tại các siêu thị và 13 mẫu tại các thị trường bán lẻ tại miền nam Đài Loan. Các mẫu Miso được xác định có nồng độ muối từ 6.1- 11.3 %. Với phương pháp ứng dụng kĩ thuật di truyền PCR khuếch đại trình tự DNA và được phân tích bằng phần mềm BLAST (NCBI) để xác định vi khuẩn hình thành histamin. Kết quả cho thấy chỉ có một mẫu không đạt về chỉ tiêu Coliform tổng số, ở mức 100 CFU/g, không có bất cứ mẫu nào nhiễm E. coli, tác giả ghi nhận rằng Miso ở nồng độ muối cao đã có tác dụng ức chế về tăng trưởng của vi khuẩn [19].
Có một đề tài khác nghiên cứu tại Trung Quốc do M. J. R. Nout, D. Bakshi và P. K. Sarkar trên đối tượng Sufu. Trong nghiên cứu này các tác giả tiến hành phân tích các chỉ tiêu độ ẩm, nồng độ muối, độ pH và các chỉ tiêu vi sinh trên 3 loại Sufu trắng, Sufu đỏ và Sufu xám. Kết quả trong 23 mẫu thu thập, vi khuẩn hiếu khí mesophilic và vi khuẩn endospores nhiễm >105 CFU/g được tìm thấy ở hầu hết các mẫu. Một phần ba số mẫu có chứa ít hơn 103 CFU/g B. cereus, nhưng ba mẫu đó cú trờn 105 CFU/g cho thấy tiềm năng gây nguy hiểm cho người tiêu dùng. Tất cả các mẫu có ít hơn 103 CFU/g C. perfringens, ngoại trừ 1 mẫu có chứa 105 CFU/g. S. Aureus, chủng nấm Enterobacteriaceae, và L. monocytogenes đã không được phát hiện trong bất kỳ của các mẫu. Dựa trên các kết quả này, có thể khẳng định Sufu là an toàn về các chỉ tiêu vi sinh không gây hại cho người cho người sử dụng [17].
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Một số sản phẩm tương Bần đang tiêu thụ tại chợ Thái và chợ Đồng Quang – TP Thỏi Nguyờn – Tỉnh Thỏi Nguyờn.
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
− Thời gian nghiên cứu: 1/2011 - 5/2011
− Địa điểm: Khoa xét nghiệm - Trung tâm y tế dự phòng Thỏi Nguyờn.
3.3. Nội dung nghiên cứu
− Xác định tổng số vi khuẩn Clostridium perfringens (C. perfringens) trong tương Bần
− Xác định tổng số vi khuẩn Coliform trong tương Bần
− Xác định tổng số vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) trong tương Bần
3.4. Phương pháp nghiên cứu
Đề tài thực hiện dựa theo những phương pháp nghiên cứu thường quy trong phòng xét nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn quốc tế (ISO) các số: 499:1991, 4882:2007 và 6846:2007.
3.4.1. Trang thiết bị và y dụng cụ dùng trong kiểm nghiệm
Các trang thiết bị và y dụng cụ gồm: − Tủ ấm (SANYO)
− Tủ Sấy (MEMMERT)
− Tủ lạnh (SANYO)
− Tủ cấy an toàn sinh học (BIOAIR) − Nồi hấp cách thủy (HYTHERMCO) − Cân điện (SATORIUS)
− Panh có mấu − Kéo inox − Que cấy − Pipet − Gang tay y tế − Đèn cồn
− Mẫu được lấy theo phương pháp lấy ngẫu nhiên tại các quầy bán tương Bần thuộc 4 loại sản phẩm, trong đó có 3 sản phẩm đã đăng kí thương hiệu được mã hóa kí hiệu: TBTT, TBBH, TBNS và 1 loại sản phẩm không có thương hiệu TB.
− Nguyên tắc lấy mẫu: Lấy mẫu phải đảm bảo tính khách quan, trung thực, đại diện, các mẫu phải còn nguyên vẹn.
− Lấy mẫu: Trước khi lấy mẫu phải đeo khẩu trang và gang tay y tế. Tại mỗi địa điểm lấy mẫu, chọn ngẫu nhiên các chai tương có thể tích 500ml, sau đó tiến hành bao gói sản phẩm vào túi nilon vô trùng, dựng bỳt dạ đỏnh kớ hiệu sản phẩm và vào nhật kí thu mẫu, chuyển vào thùng chứa để vận chuyển về nơi xét nghiệm.
− Mẫu sau khi được đưa về nơi xét nghiệm, nếu chưa được phân tích ngay phải được bảo quản vào nơi thoáng mát, vô trùng.
− Kết quả lấy mẫu được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả lấy mẫu
STT Địa điểm Số lượng quầy Tổng số mẫu
1 Chợ Thái 5 20 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2 Chợ Đồng Quang 5 24
Tổng số 10 44
(Nguồn: Kết quả điều tra)
3.4.3. Phương pháp định lượng vi khuẩn C. perfringens trong Tương Bần
Áp dụng theo TCVN 499:89 (ISO 7937:1985) - Vi sinh vật học. Hướng dẫn chung đếm Clostridium perfringens - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc bằng phương pháp ống thạch [1].
3.4.3.1. Nguyên tắc:
Vi khuẩn C. perfringens nuôi cấy trong môi trường thạch Wilson Blair ở 370C, trong điều kiện kị khí sau 24 giờ sẽ phát triển thành các khuẩn lạc có màu đen, tròn lồi.
3.4.3.2. Môi trường sử dụng
− Dung dịch đệm pepton BPW. Thành phần gồm: + Nước cất 1000ml
+ Pepton wasser 25,5g
− Môi trường nuôi cấy khẳng định C. perfringens là môi trường thạch Wilson Blair, pH 7,2 - 7,4. Thành phần môi trường gồm các hóa chất thuộc hãng MERCK của nước Đức, được pha theo công thức:
+ Nước cất 200ml + Cao thịt 1g + NaCl 1g + Thạch bột 4g + Pepton 2g + Glucoza 4g
Đun sôi hòa tan các chất, thử độ pH = 7,2 - 7,4, sau đó rót vào ống khuẩn tà, mỗi ống chứa 20 - 30ml môi trường. Hấp ở 1100C/ 30 phút, nếu chưa dùng ngay phải bảo quản trong tủ lạnh 0 - 40C.
3.4.3.3. Chuẩn dung dịch mẫu thử
− Hút chính xác 25ml thực phẩm đã được chuẩn bị cho vào bỡnh nún chứa sẵn 225ml nước muối đệm pepton (BPW).
− Lắc đều 2 - 3 phút. Thu được dung dịch mẫu thử 10-1
− Hút chính xác 10ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 90ml nước muối đệm pepton. Lắc đều trong 2 - 3 phút. Thu được dung dịch 10-2. Tiếp theo làm như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-2, 10-3, 10-4…
3.4.3.4. Các bước tiến hành:
− Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử như ở trên, tùy theo mức độ sạch, bẩn của mẫu mà pha loãng đến đậm độ dùng nuôi cấy.
− Đun ống thạch Wilson Blair để tan chảy thạch, để nguội khoảng 500C, cho vào thạch 10ml dung dịch mẫu thử, lắc đều. Mỗi nồng độ cấy 2 ống. Mỗi
ống cho thêm 2ml dung dịch Na2SO3 20% và 5 giọt phèn sắt 5%. Lắc trộn đều để cho các chất hòa đểu vào trong thạch. Các bước phải thực hiện nhanh chóng để thạch không kịp đông trở lại.
− Đun ống thạch trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 75 0C trong 15 phút nhằm mục đích tạo môi trường kị khí cho vi khuẩn C. perfringens phát triển, sau đó cần làm nguội nhanh.
− Ủ trong tủ ấm 37 0C/ 18 - 24h.
3.4.3.5. Tính kết quả:
− Quan sát trong ống thạch xuất hiện những khuẩn lạc C. perfringens có màu đen, đường kính ≥ 3mm.
− Tổng số vi khuẩn có trong 1ml mẫu được tính bằng cách lấy trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ có trong hai ống nghiệm nuôi cấy cùng nồng độ nhân với hệ số pha loãng tương ứng và chia cho 10.
3.4.4. Phương pháp định lượng tổng số Coliform
Áp dụng theo TCVN 4882:2007, ISO 483:2006 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Coliform -
Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất [2].
3.4.4.1. Nguyên tắc: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ kế tiếp nhau cách nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 ống. Theo dõi sự sinh hơi và làm đục màu môi trường trong ống nghiệm. Xác định ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng sau khi nuôi cấy vào các ống canh thang Brilliant Green Bile Lactose Broth ở 370C/ 24 - 48 giờ và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g hay 1 ml ban đầu.
3.4.4.2. Chuẩn bị hóa chất
− Dung dịch pha loãng mẫu là dung dịch đệm pepton BPW. Thành phần gồm: + Nước cất 1000ml
− Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Coliform là môi trường canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ kép và canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ đơn, được đóng sẵn dạng bột (hãng MERCK). Khi sử dụng pha theo công thức:
+ Canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ kép được pha chế theo tỷ lệ 71,2 g lauryl sunfat trong 1000ml nước cất.
+ Canh thang tryptoza lauryl sunfat nông độ đơn được pha chế theo tỷ lệ 35,6g lauryl sunfat trong 1000ml nước cất.
− Môi trường cấy chuyển Coliform là môi trường canh thang xanh brilliant lactose mật bò (Brilliant Green Bile Lactose Broth – BGBL).
Thành phần gồm: + Pepton 10g + Lactose 10g + Mật bò 20g + Brilliant green 0,0133g + Nước cất 1000ml
− Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng được chế biến theo công thức chỉnh pH = 7,4. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bỡnh nún, ống nghiệm được hấp tiệt trùng (110 0C).
3.4.4.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử:
− Hút chính xác 25ml mẫu cho vào bình nón chứa 225ml nước muối đệm pepton (BPW). Lắc đều trong 2 phút. Thu được huyền phù ban đầu 10-1.
− Dùng pipet vô trùng hút 10ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa sẵn 90ml dung dịch BPW, lắc đều. Thu được dung dịch pha loãng 10-2, tiếp tục như vậy ta thu được các dung dịch mẫu 10-3, 10-4…
3.4.4.4. Các bước tiến hành:
− Nuôi cấy mẫu
+ Đối với độ pha loãng 10-1: Dùng pipet vô trùng chuyển vào bộ ba ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc canh thang tryptoza laury
sunfat nồng độ kép 10ml mẫu thử. Sau đó dùng pipet vô trùng chuyển vào bộ ba ống nghiệm chứa 9ml canh thang tryptoza laury sunfat nồng độ đơn 1ml mẫu thử.
+ Đối với nồng độ pha loãng tiếp theo, dùng pipet vô trùng chuyển vào mỗi ống bộ ba ống nghiệm chứa 9ml canh thang tryptoza laury sunfat nồng độ đơn1ml mẫu thử.
+ Để ống canh thanh trên vào trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C/ 24h (nếu giai đoạn này không sinh khí , và mờ đục môi trường thì ủ tiếp đến 48h)
+ Đọc các ống dương tính : làm đục canh thang và sinh hơi. − Cấy chuyển khẳng định
+ Từ các ống dương tính trờn, dựng que cấy vô trùng cấy chuyển tương ứng canh trùng sang những ống môi trường thử khẳng định (canh thang mật lactoza lục sáng ).
+ Ủ trong tủ ấm 370C/ 24h.
3.4.4.5. Tính kết quả:
− Xác định và ghi lại số ống dương tính ở từng độ pha loãng: Đục canh thang, sinh hơi, và chuyển màu canh thang từ xanh đậm sang xanh nhạt.
− Từ những ống dương tính, tra bảng MPN để xác định tổng số Coliform có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm.
3.4.5. Phương pháp định lượng tổng số E. coli
Áp dụng theo TCVN 6846: 2007, ISO 7251: 2006 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng E. coli giả định - Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất [3].
3.4.5.1. Nguyên tắc
Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ kế tiếp nhau cách nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 ống. Theo dõi sự sinh hơi trong ống nghiệm. Xác định ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng sau khi nuôi cấy vào các ống canh thang Escherichia coli Broth (canh thang EC) ở 440C/ 24 -
48 giờ, cho thử nghiệm sinh Indol dương tính và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g hay 1 ml ban đầu.
3.4.5.2. Môi trường sử dụng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
− Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn E. coli là môi trường
canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ kép và canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ đơn được đóng sẵn dạng bột tryptoza lauryl sunfat (hãng MERCK của nước Đức). Khi sử dụng được pha theo công thức.
+ Canh thang tryptoza lauryl sunfat nồng độ kép được pha chế theo tỷ lệ 71,2g lauryl sunfat trong 1000ml nước cất.
+ Canh thang tryptoza lauryl sunfat nông độ đơn được pha chế theo tỷ lệ 35,6g lauryl sunfat trong 1000ml nước cất.
− Môi trường cấy chuyển E. coli là môi trường canh thang EC. Thành phần gồm:
+ Lactoza: 5g
+ Muối mật (bile salt): 1,5g + NaCl: 5g
+ Dịch thủy phân casein bằng enzyme: 20g
+ K2HPO4: 4g + KH2PO4: 1,5g + Nước cất: 1000ml
− Dung dịch pha loãng mẫu (dung dịch đệm pepton BPW). Thành phần gồm:
+ Nước cất 1000ml + Pepton wasser 25,5g
− Môi trường nuôi cấy, canh thang EC, nước pha loãng được chế biến theo công thức. Các môi trường được đun sôi hòa tan hoàn toàn, hấp tiệt trùng (1100C), để nguội, sau đó được đóng sẵn vào bình cầu, bỡnh nún, ống nghiệm. Bảo quản ở nhiệt độ 40C.
3.4.5.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
− Hút chính xác 25ml mẫu đã được chuẩn bị cho vào bỡnh nún chứa sẵn 225ml nước muối đệm pepton (BPW). Lắc đều trong 2 phút. Thu được huyền phù ban đầu 10-1.
− Dùng pipet vô trùng hút 10ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa sẵn 90ml dung dịch BPW, lắc đều. Thu được dung dịch pha loãng 10-2, tiếp tục như vậy ta thu được các dung dịch mẫu 10-3, 10-4…
3.4.5.4. Các bước tiến hành:
− Nuôi cấy mẫu
+ Đối với độ pha loãng 10-1: Dùng pipet vô trùng chuyển vào bộ ba ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc canh thang tryptoza laury sunfat nồng độ kép 10ml mẫu thử. Sau đó dùng pipet vô trùng chuyển vào bộ ba ống nghiệm chứa canh thang tryptoza laury sunfat nồng độ đơn 1ml mẫu thử.
+ Đối với nồng độ pha loãng tiếp theo, dùng pipet vô trùng chuyển vào mỗi ống bộ ba ống nghiệm chứa canh thang tryptoza laury sunfat nồng độ đơn 1ml mẫu thử.
+ Để ống canh thang trên vào trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C/ 24h (nếu giai đoạn này không sinh khí, và mờ đục môi trường thì ủ tiếp đến 48h
+ Đọc các ống dương tính: Làm đục canh thang và sinh hơi. − Cấy chuyển khẳng định
+ Cấy chuyển và ủ môi trường chọn lọc (canh thang EC): Từ các ống dương tính trờn, dựng que cấy vô trùng cấy chuyển sang những ống môi trường canh thang EC, mỗi ống 1 vòng cấy. Ủ ấm 440C/ 24 - 48h. Xác định và ghi lại ống dương tính ở từng độ pha loãng: Đục canh thang, sinh hơi.
+ Cấy và ủ môi trường nước pepton: từ những ống dương tính trên,