C- Ảnh hưởng của cấu hình thiết bị MBRs
A- Acid lactic
Acid lactic được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và hóa chất. Tuy nhiên, lên men lactic chỉ mới được chú ý gần đây do tăng nhu cầu sử dụng nguồn vật liệu mới như là những sản phẩm polylactic khử sinh học và tương hợp sinh học. Những polymer và co-polymer của L-lactate này có tiềm năng rộng lớn trong bao bì đóng gói, cũng như thuốc men cho con người.
Acid lactic có công thức cấu tạo là CH3-CH(OH)-COOH, có dạng lỏng, từ không màu đến màu vàng nhạt, có vị chua nhẹ. Trong công nghệ thực phẩm, acid lactic đóng vai trò như là chất điều vị, chất chỉnh pH, chất bảo quản.
Phương pháp hiệu quả để tổng hợp L-lactic không phải bằng con đường hóa học mà bằng con đường tổng hợp sinh học, cụ thể là sử dụng kỹ thuật lên men với một số giống vi sinh vật có thể sản sinh ra khối lượng lớn acid lactic, như: Lactobacillus helveticus, L.
casei, L. salivarius, L. delbrueckii… (A.Olmos-Dichara et al. 1997)
Phương pháp lên men truyền thống sử dụng tế bào tự do bằng phương pháp lên men tĩnh có thể nói là phổ biến trong công nghiệp sản xuất acid lactic nhưng hiệu suất lên men thấp do sự ức chế sản phẩm cuối. Acid lactic là chất trao đổi bậc một, sản phẩm acid lactic hoàn toàn phụ thuộc vào sự sinh trưởng tế bào vi sinh vật và tổng sinh khối.
Lên men liên tục mặc dù khắc phục được một số vấn đề trong lên men tĩnh nhưng lại bị rửa trôi tế bào. Để tăng đáng kể hiệu suất, cần phải sử dụng nồng độ tế bào cao và loại bỏ sự ức chế sản phẩm từ canh trường lên men. (S. Tejayadi và M. Cheryan 1995)
Rất nhiều bài báo nghiên cứu về việc nâng cao hiệu quả trong sản xuất acid lactic, đặc biệt là đưa ra những mô hình mới, làm sao có thể khắc phục những nhược điểm vừa nêu, cũng như tìm ra những giải pháp để giai đoạn thu nhận và tinh sạch sản phẩm được tiến hành dễ dàng. Dưới đây là bảng thống kê so sánh một số mô hình mà người ta đã khảo sát trong lên men acid lactic:
Bảng 3.1. So sánh giữa các mô hình lên men trong sản xuất acid lactic (H. Danner 2002)
Giống VSV Mô hình D (h-1) Sinh khối (g/L) Lactate (g/L) % (g/g)
Tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm (g/L.h)
Lactobacillus bulgaricus
(Tejayadi và Cheryan 1995) MRB
0.5 0.5 0.25 40 40 - 46 70 89 0.92 0.93 0.89 33 35 22 Lactobacillus delbrueckii NRRL-B445 (Vick Roy et al. 1983)
CRR CSTR Tĩnh - - - 54 7-8 7-8 35 38 45 0.96 - - 76 7 1-2 Lactobacillus bulgaricus
(Mehaia và Cheryan 1987) CRR
0.72 - 63 - 117 - - - 84 - Lactobacillus delbrueckii (Ohleyer et al. 1985) CRR - - 60 - 150 Lactobacillus delbrueckii
(Crespo và Carrondo 1994)
CRR CRR CSTR 0.2 0.4 0.06 102 148 3.9 81.6 105.8 52.2 0.84 0.8 0.83 16.3 42.3 3.1
Dựa vào bảng 3.1, ta thấy được trong sản xuất acid lactic, thường người ta chỉ dùng loài
Lactobacillus. Tuy nhiên, có sự khác nhau rất rõ giữa các mô hình sử dụng cũng như kết
quả đã đưa ra. Phương thức lên men tĩnh và lên men trong CSTR cho lượng sinh khối thấp hơn rất nhiều, dẫn đến tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm cũng rất thấp so với việc sử dụng thiết bị lên men có membrane hay có hồi lưu tế bào.
Một số mô hình MBRs đã được đề xuất trong sản xuất acid lactic:
1. MCRB vận hành liên tục có sử dụng bơm màng chắn (diaphragm pump) và điều khiển tốc độ tiếp tuyến (tangential velocity) trong quá trình vận hành: (Guo et al. 2006)
a. Mô hình cụ thể
Hình 3.1. Sơ đồ MCRB liên tục trong sản xuất acid lactic.
1- bình lên men; 2- membrane MF; 3- bình chứa dòng permeate; 4- bình chứa môi trường; 5- bộ phận chỉnh pH; 6, 7, 8- bơm
− Bình lên men (Shanghai Guoqiang Equipment Company, PR China) có cài đặt các đầu dò pH, DO, nhiệt độ, bọt.
− Membrane MF làm bằng chất liệu PDVF ái nuớc (Pellicon® 2 filter, 0.45μm, 0.1m2, Milipore, USA). Thiết bị membrane này được gắn vào khung thép không rỉ Pellicon (Milipore), cố định trên đó 3 van áp suất ở đường vào và đường ra. Có thể làm sạch và tiệt trùng membrane ngay trong quá trình vận hành hệ thống.
− Bơm màng chắn hoạt động bằng khí nén (P.025, USA) sử dụng để tạo lực cho dòng chảy qua màng. Tốc độ tiếp tuyến của membrane được điều khiển bởi đồng hồ điện tử đo lưu lượng (AMF 10103, Anjun E-tech, China) và van sử dụng màng chắn
(Bioengineering, Switzerland) được đặt giữa bơm và module màng. Các ống trong hệ thống đều chịu được áp lực.
− Cách vận hành hệ thống tương tự như đã trình bày trong chương 1. b. Phương pháp
− Sử dụng giống vi sinh vật Lactobacillus paracasei
− Môi trường cho lên men gồm: glucose, peptone, chất chiết nấm men YE, natri acetate, muối magie – mangan – sắt sulfate, natri clorua.
− Glucose ban đầu cho vào là 100g/L, nồng độ glucose sót điều chỉnh về 5g/L.
− Hệ thống MCRB được bắt đầu vận hành từ quá trình lên men tĩnh trước, kéo dài khoảng 8-10h sau khi cấy giống. Thể tích làm việc của bình lên men được giữ không đổi bằng cách bổ sung môi trường để cân bằng với dòng permeate qua membrane. Điều kiện nuôi cấy trong MCRB khoảng 410C, tốc độ cánh khuấy 210rpm, pH điều chỉnh về 6. Giá trị oxy hòa tan trong canh trường (DO) được giữ ở 5% so với mức bão hòa. Trong suốt quá trình, canh trường được lấy mẫu cách mỗi 3-4h.
− Giá trị tốc độ pha loãng D ổn định trong 100h đầu là 0.3h-1, 20h tiếp theo người ta nâng lên 0.4h-1, và sau đó lại chỉnh về 0.3h-1.
− Tốc độ tiếp tuyến giữ ổn định ở 0.75m/s. − Làm sạch và tiệt trùng hệ thống membrane:
Làm sạch bằng dung dịch 5L NaOCl, có chứa 250ppm chlorine hoạt tính được pha loãng với nước. Nhiệt độ làm sạch ở 40-500C. Sau khoảng 30-50phút, rửa lại membrane bằng 2L nước vô trùng để loại bỏ NaOCl còn sót trong thiết bị. Cả hệ thống được làm sạch và tiệt trùng với áp suất trong - ngoài của dòng nước ngược và áp suất dòng permeate được cài đặt lần lượt ở 1.5-2bar, 0.3 bar, 0 bar, tổng thời gian thực hiện khoảng từ 0.6-1h.
c. Kết quả
Kết quả quá trình lên men trong MCRB với cấu tạo như trên được thể hiện trong hình 3.2
Hình 3.2. Đánh giá hàm lượng acid lactic sinh ra, sinh khối tế bào và hiệu suất quá trình khi thực hiện ở MCRB trong 155.5h
Có thể thấy rằng hệ thống được lên men liên tục khá ổn định trong 150h. Hơn nữa, có quá trình làm sạch và tiệt trùng (đã nêu chi tiết ở phần b), quá trình lọc trên membrane được cải thiện nhanh chóng, trở lực chỉ tăng 2-8% trong khi lọc. Nồng độ acid lactic trong phương pháp lên men này chỉ bằng ½ so với phương pháp lên men fed-batch, nhưng giá trị tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm và sinh khối OD620 tăng cao. Xét ở giá trị D=0.3h-1, OD620
(98.7) tăng gấp 6 lần và tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm (31g/L.h) tăng gấp 10 lần so với lên men fed-batch. Khá rõ ràng là việc tách acid lactic từ canh trường lên men rất hiệu quả cho cả sự phát triển vi khuẩn cũng như là sự sinh tổng hợp sản phẩm acid lactic.
Trong suốt giai đoạn nuôi cấy tĩnh ban đầu, tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm tăng cùng lúc với sự gia tăng giá trị OD620. Tuy nhiên, ở giai đoạn MF, mối quan hệ này không rõ ràng. Trong khi giá trị OD620 tăng 3.7 lần từ 20-40h, tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm vẫn không thấy tăng lên rõ. Richter và Nottelmann (2004) đã quan sát kết quả và cho rằng việc tăng nồng độ sinh khối quá giá trị cân bằng sẽ không cải tiến được sản lượng acid lactic trong lên men cùng với việc giữ lại toàn bộ tế bào. Kết quả này chỉ ra được rằng không phải tế bào vi sinh vật nào cũng hiệu quả cho việc sản xuất acid lactic.
d. So sánh với các mô hình khác
Đáng được quan tâm nữa là khi đối chiếu hệ thống MCRB ở trên (sử dụng bơm màng chắn và điều khiển tốc độ dòng chảy tiếp tuyến) với các hệ thống MCRB khác, ta thu được kết quả dưới đây:
Bảng 3.2. So sánh kết quả giữa 3 hệ thống MCRB
Các thông số
MCRB với bơm nhu động MCRB với bơm có màng chắn
MCRB với bơm có màng chắn và đồng hồ điện tử đo lưu lượng (mô hình đã phân tích) Tốc độ tiếp tuyến (m/s)
Áp suất truyền cực đại (bar) Tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm cực đại (g/L.h)
Hiệu suất sản phẩm cực đại OD620 cực đại
Thời gian (h) Nguy cơ nhiễm vsv
- 2.9 25.7 0.86 75.8 56 Ống bể - 4.6-5.6 28.2 0.86 80 85 Tắc nghẽn 0.75 5-6 31.5 0.85 98.7 155.5 Không có nguy cơ. Trong khi bơm nhu động (Longer precision pump company, China) được sử dụng để tạo lực đẩy dòng chảy qua màng, các ống dẫn sẽ bị nứt thủng và mài mòn rất nhanh, kết quả là làm bể ống dẫn khi tăng tốc độ rotor của bơm quá cao. Đối với MCRB dùng bơm nhu động, giá trị OD620 tăng 75.8 ở 56h, lực truyền tăng khoảng 2.9 bar. Rõ ràng, các ống trương nở và loãng hơn, sau đó là nứt vỡ nhanh chóng. Lên men bị gián đoạn khi xảy ra nhiễm trên các ống bị thủng.
Vấn đề này có thể được xử lý bằng cách thay bơm nhu động bằng bơm có màng chắn. Các ống chịu áp suất được thay cho các ống mềm, từ đó quá trình vận hành trên bơm có màng chắn cũng khác. Hệ thống này chạy đảm bảo trong thời gian dài với lực truyền có thể lên 6 bar. Hơn nữa, hệ thống có màng chắn cho phạm vi dòng chảy rộng hơn. Có thể thấy ở bảng trên là hiệu suất cực đại và giá trị OD620 của MCRB có màng chắn cao hơn so với MCRB có bơm nhu động (nhưng không nhiều).
Tuy nhiên, nếu chỉ một mình bơm có màng chắn cũng không giải quyết được mọi vấn đề bởi vì membrane của cả hai hệ thống bị tắc rất nhanh. Dòng permeate giảm từ 9.6L/h.m2
còn 2.7 L/h.m2 trong 82h nuôi cấy. Tiến hành đo độc lập sau khi kết thúc quá trình, tốc độ dòng chảy do bơm phát ra khoảng 18L/h (tương đương với tốc độ tiếp tuyến 0.19m/s), thấp hơn nhiều so với tốc độ dòng chảy chuẩn là 72L/h (tương đương với tốc độ tiếp tuyến 0.75m/s) yêu cầu của membrane. Điều này cho thấy membrane dễ bị tắc nghẽn nhanh chóng trong quá trình vận hành.
Vì vậy, giữ được tốc độ tiếp tuyến của membrane là một trong những phương pháp thành công để tránh các hiện tượng này. Canizares et al. (2005) nghiên cứu việc cài thêm cần thép bên trong membrane ống ceramic, cho thấy giảm đường kính thủy lực (D=4A/U) có thể cải tiến được tốc độ tiếp tuyến, nhằm tránh hiện tượng phân cực và làm giảm tắc nghẽn. Rossignol et al. (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ tiếp tuyến đến dòng permeate.Kết quả cho thấy dòng permeate tăng khi tăng tốc độ tiếp tuyến. Hơn nữa, Levente L. Diosady và Taya Puzanov (2005) chỉ ra rằng dòng lọc tiếp tuyến có thể cho nồng độ sinh khối cao vì tế bào vi sinh vật liên tục được hồi lưu về bình lên men. Mật độ tế bào mà nhiều không chỉ làm gia tăng sản lượng acid lactic mà còn giảm thiểu nguy cơ nhiễm bởi vi sinh vật từ môi trường bên ngoài. Vì vậy, hệ thống có mật độ tế bào cao sẽ làm tăng hiệu quả trong sản xuất acid lactic.
Tuy nhiên vẫn chưa dừng lại ở đó, đồng hồ điện tử đo lưu lượng có thể đo tốc độ dòng chảy trực tiếp khi hệ thống đang vận hành. Đồng hồ này có nhiều tính chất thích hợp như đảm bảo độ kín và có thể được tiệt trùng trực tiếp bằng hóa chất hay bằng hơi nước. Hơn nữa, do điều khiển tốc độ dòng chảy trực tiếp trên hệ thống, tốc độ tiếp tuyến cũng được điều chỉnh ở mức độ thích hợp. Với hệ thống này, kết quả thu được là tốt nhất với tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm đạt cực đại là 31.5g/L.h và giá trị OD620 lên đến 98.7, hơn nữa, quá trình vận hành liên tục trong khoảng thời gian rất dài, kéo đến 155.5h.
2. Mô hình MBR với 2 membrane đồng trục nằm bên trong bình lên men (H. Moueddeb et al. 1996)
a Mô hình cụ thể : được mô tả như sau
− A là vùng trong, B và D là 2 membrane vô cơ, C là khoảng không gian hình vành khuyên, E là vùng ngoài.
− Thiết bị dạng ống bao gồm 2 membrane có hình ống đồng trục với nhau (US Filters).
− Membrane B có đường kính trong 7mm, bao gồm giá mang và lớp MF kích thước lỗ là 0.2μm áp sát mặt trong membrane B. Membrane D có đường kính ngoài 19mm và có lớp MF áp sát mặt ngoài.
− Nuôi cấy vi khuẩn thực hiện trong vùng không gian C xác định giữa 2 membrane, vi sinh vật được cố định trên giá mang xốp và giới hạn trong vùng C này.
− Trong suốt quá trình, dung dịch lactose được châm vào vùng A, dung dịch này thấm qua membrane và ra theo vùng E. Mô hình đặc biệt này cho phép chuyển hóa lactose thành acid lactic trong khoảng không gian giữa 2 lớp MF, tránh ức chế vi khuẩn do sản phẩm sinh ra.
b Thiết kế thí nghiệm
Hình 3.4. Sơ đồ vận hành hệ thống MBR
1- bồn chứa nguyên liệu; 2, 4, 5- bơm nhu động; 3- membrane bioreactor; 6- dung dịch kiềm; 7- bồn chứa permeate và cân bằng; 8- thiết bị đo pH; 9- máy tính.
− Cơ chất S0 từ bồn chứa nguyên liệu được đưa vào reactor qua bơm, với lưu lượng Q gấp 10 lần so với giá trị ban đầu mà dòng môi trường thấm qua membrane, cần châm liên tục chất lỏng mới từ bồn 1 vào để bù cho lượng cơ chất thấm qua màng. Bơm 4 được điều chỉnh để thu dòng permeate. Để tránh hiện tượng nhiễm, pH được điều chỉnh về 3 trong bồn chứa nguyên liệu và trong chu trình hồi lưu S về bồn này. − Nhiệt độ reactor giữ ở 380C, giá trị pH là 6 và được điều chỉnh tự động bằng cách
bằng 7, tức là lưu lượng dòng permeate phải cân bằng với lưu lượng dòng vào. pH và lưu lượng dòng permeate được ghi nhận bởi máy tính.
− Sử dụng vi sinh vật Lactobacillus rhamnosus (Standa Industries), giống này ko bị ảnh hưởng bởi oxy và sản sinh chủ yếu là L(+) acid lactid.
− Môi trường lên men gồm có whey permeate, lactose, YE, MnSO4, Tween 80. c Kết quả
Hình 3.5. Đánh giá hiệu quả quá trình sản xuất acid lactic trong hệ thống MBR đã mô tả ở trên.
Với nồng độ lactose ban đầu là 28g/L, lưu lượng dòng permeate đầu tiên là 5L/h.m2
(dòng permeate ở đây là dòng cơ chất thấm qua membrane để vi sinh vật thực hiện quá trình lên men sản sinh acid lactic).
Trong suốt quá trình có sự giảm liên tục dòng permeate từ 5 xuống còn 1 L/h.m2. Vấn đề này có liên quan đến sự gia tăng sinh khối, gây tắc nghẽn membrane, hạn chế lưu lượng dòng permeate.
Ta thấy sau 90h vận hành, lactose thấm toàn bộ qua membrane, sản phẩm sinh ra quan sát được chỉ có acid lactic. Từ đó rút ra kết luận rằng hệ thống này có thể vận hành liên tục trong thời gian dài để chuyển hóa hết toàn bộ cơ chất.
3. Hệ thống MBR có kết hợp thiết bị thẩm tách điện một cực trong điều kiện nhiệt độ cao để sản xuất acid lactic (H. Danner et al. 2002)
Nuôi cấy vi khuẩn trong điều kiện ưa nhiệt trên 600C được chú ý trong vài năm trở lại đây. Điều kiện này được khảo sát để có thể thực hiện quá trình lên men trong điều kiện không cần vô trùng, mà cụ thể ở đây là nhiệt độ nuôi cấy cao có thể được sử dụng sản xuất acid lactic liên tục bằng giống Bacillus stearothermophilus ưa nhiệt. Yêu cầu cho giống ưa nhiệt này là phát triển ổn định trong điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ cao kéo dài, người ta đã chọn giống Bacillus strains BS 119. Giống này có khả năng lên men hexose và pentose, sản