CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH VẬN HÀNH MBRs

MEMBRANE BIOREACTOR

Quá trình vận hành MBR khá phức tạp, trải qua nhiều giai đoạn nên việc xét các yếu tố ảnh hưởng của nó đến chất lượng sản phẩm không phải là điều dễ dàng, cần phải tối ưu hóa bài toán đa biến.

Khá nhiều nghiên cứu đã trực tiếp khảo sát các điều kiện vận hành cũng như tối ưu hóa những thông số công nghệ khác nhau trong MBRs. Theo Giorno et al (2003), các thông số cần tối ưu hóa gồm có các yếu tố thuộc quá trình chuyển hóa sinh học (chủng loại vi sinh vật, hoạt tính giống, động học phản ứng, nguồn cơ chất, độ nhớt dòng vào và dòng ra…), các thông số hình học của membrane (hình dạng, cấu tạo, trạng thái, kích thước lỗ…) và các thông số thủy động lực học (áp suất qua màng, tốc độ dòng chảy…).

A. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

Quá trình lên men trong MBR cũng giống như quá trình lên men trong các CSTR, thường đối với sản xuất công nghiệp, quá trình này được tóm tắt theo sơ đồ cân bằng vật chất như sau:

Môi trường trước lên men Canh trường sau lên men

Cơ chất + giống vi sinh vật  Cơ chất sót + Sinh khối vi sinh vật + các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào do vi sinh vật tổng hợp nên. Trong MBRs ứng dụng công nghiệp thực phẩm, canh trường sau lên men được đưa qua thiết bị membrane để tiếp tục lọc tách vi sinh vật, vì vậy thường dòng permeate của hệ thống này là những sản phẩm trao đổi chất từ vi sinh vật, như dung môi hữu cơ (ethanol, butanol, acetone…), acid hữu cơ (acid lactic, citric…), acid amin (lysine, acid glutamic…), hoặc các enzyme do vi sinh vật tiết ra (protease, amilase, pectate lyase, glucosidase…). Do đó, các nhà sản xuất luôn đặt mục tiêu hàng đầu là tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm phải càng cao càng tốt. Thực tế, một giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp rất nhiều sản phẩm trao đổi chất, vấn đề đặt ra là ta muốn thu nhận sản phẩm nào, điều đó tùy thuộc vào sự kết hợp đồng thời của 3 yếu tố:

- Giống vi sinh vật - Môi trường lên men

- Điều kiện lên men: lượng giống cấy, nhiệt độ, thời gian lên men, việc cung cấp oxy, tốc độ khuấy trộn…

Ngoài ra, các nhà sản xuất cũng rất quan tâm đến các tính chất vật lý của dòng canh trường ra khỏi bình lên men, làm sao để quá trình phân riêng trên membrane được hiệu quả trong quá trình vận hành hệ thống MBRs này.

1. Giống vi sinh vật

Việc chọn giống vi sinh vật phù hợp là yếu tố quan trọng trong quá trình lên men. Giống vi sinh vật này phải thỏa mãn các điều kiện như khả năng sinh tổng hợp độc tố là thấp nhất, khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính phải cao nhất.

Sự ổn định các hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật trong lên men với hệ thống MBRs cũng cần được chú ý, vì đối với hệ thống này có sự cố định hay hồi lưu tế bào, do đó đặc tính môi trường và điều kiện vận hành luôn chuyển biến, đòi hỏi vi sinh vật phải có khả năng thích nghi cao và chống chịu tốt, để làm sao các tính chất ưu việt của giống vi sinh vật được đảm bảo trong thời gian vận hành dài.

Ngoài ra, yếu tố môi trường và điều kiện vận hành cũng ảnh hưởng đến việc chọn giống vi sinh vật. Trong sản xuất quy mô công nghiệp, các nhà sản xuất luôn muốn tìm ra được nguồn nguyên liệu phổ biến, rẻ tiền, điều kiện lên men không quá phức tạp, dễ điều khiển, do đó đòi hỏi giống vi sinh vật lên men cũng phải thích hợp với những nguồn nguyên liệu đó, điều kiện đó, như vậy hiệu suất quá trình mới có thể được nâng cao. Chẳng hạn như: theo H. Danner et al. (1998) trong sản xuất acid lactic, ông muốn thực hiện quá trình lên men ở nhiệt độ cao 600C, để có thể lên men trong điều kiện không cần vô trùng với xác suất nhiễm là thấp nhất, vì vậy, ông đã chọn ra giống vi khuẩn Bacillus sterothermophilus BS 119 – giống này có khả năng lên men hexose và pentose, sản xuất chủ yếu acid lactic với độ tinh sạch 98%, có thể phù hợp với điều kiện đã đưa ra.

− Ngoài ra, theo Soun-Gyu Kwon (2005), các chủng nấm men Candida tropicals khác nhau cũng sẽ cho kết quả lên men khác nhau trong mô hình có hồi lưu tế bào.

Bảng 2.1. Sự khác nhau trong quá trình lên men xylitol giữa các chủng nấm men C. tropicals tropicals

Nấm men Xylose

(g/L) Xylitol (g/L) QP (g/L.h) YP/S (g/g) Tf (h)

Số chu kỳ hồi lưu C. tropicals ATCC 13803 C. tropicals KCTC 7221 C. tropicals KCTC 10457 230 136 214 189 110 182 4.94 5.42 12 0.82 0.81 0.85 38 20 15 1 14 10

− Giống vi sinh vật cũng gây ảnh hưởng đến dòng chảy của canh trường sau lên men trong cùng điều kiện làm sạch bằng khí, dưới áp suất 288 Torr. Kết quả thể hiện ở bảng 2.2. (T. Asakura và K. Toda 1991)

Bảng 2.2. So sánh lưu lượng dòng canh trường trong quá trình làm sạch membrane thủy tinh ứng với các giống vi sinh vật khác nhau

Vi sinh vật Lưu lượng dòng chảy (m3/m2.h)

Z. mobilis S. carlsbergensis

Nấm men bánh mì

0.074 0.029 0.023 Với nồng độ sinh khối là 200 kg/m3.

Qua đó, các nhà sản xuất có thể chọn giống vi sinh vật phù hợp nhằm mục đích đem lại hiệu quả kinh tế cao trong suốt quá trình.

2. Môi trường lên men

Về lý thuyết môi trường là nguồn carbon, nitơ, khoáng, các yếu tố sinh trưởng…, tuy nhiên, khi tỷ lệ các nguồn cơ chất này thay đổi thì hướng sản phẩm cũng sẽ thay đổi theo. Chẳng hạn như đối với sản phẩm là enzyme amilase thì nguồn cơ chất chủ yếu là tinh bột, còn đối với sản phẩm là protease, protein sẽ đóng vai trò chủ lực.

Không những thế, các thành phần trong môi trường lên men còn tạo nên giá trị pH và áp suất thẩm thấu. Hai yếu tố này ảnh hưởng khá đáng kể đến sự sinh trưởng và hoạt tính sinh tổng hợp sản phẩm của vi sinh vật.

Một môi trường với thành phần cơ chất đầy đủ, theo tỷ lệ tối ưu sẽ giúp cho quá trình lên men diễn ra nhanh và sản phẩm sau lên men đạt được yêu cầu do các nhà sản xuất đề ra. Rất nhiều bài báo đã nghiên cứu về vấn đề này.

a. Các thành phần trong môi trường và việc bổ sung thêm nguồn cơ chất

Akinori Ogawa et al. (1995) đã khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nguồn carbon và nitơ đến hàm lượng sản phẩm trong sản xuất enzyme protease bằng mô hình MSLC lên men tĩnh có lặp lại trong thời gian dài, sử dụng loài vi sinh vật Aspergillus oryzae IAM 2704. Kết quả thể hiện như bảng 2.2.

Bảng 2.3. Ảnh hưởng của việc thay đổi nồng độ glucose và casein trong môi trường

Nồng độ glucose (%w/v)

Nồng độ casein (%w/v)

Hàm lượng protease (đơn vị hoạt độ/L) 0.05 0.2 0.5 0.5 0.5 1 1.5 0.4 0.4 0.1 0.4 1 0.4 0.4 900 1550 1350 1500 1250 1200 1100

Hàm lượng sản phẩm protease phụ thuộc vào nồng độ cả 2 chất. Đối với trường hợp 0.5% glucose, protease sản sinh là cao nhất khi nồng độ casein là 0.4%. Còn trong trường hợp nồng độ casein là 0.4% thì hàm lượng protease cực đại khi nồng độ glucose là 0.2%. Hàm lượng protease giảm khi tăng glucose lên 1 hay 1.5%, có thể vì glucose là lượng sử dụng chủ yếu để vi sinh vật sinh trưởng, chứ không phải sinh tổng hợp sản phẩm. Với 0.05% glucose và 0.4% casein, protease là thấp nhất do không đủ cơ chất cho nấm mốc sử dụng.

Có thể kết luận rằng nồng độ glucose ở mức thấp sẽ hiệu quả cho việc sinh tổng hợp enzyme, không những vậy, ở mức glucose thấp tương đối, nấm mốc có thể sử dụng nguồn năng lượng do trao đổi chất từ casein, từ đó có thể sản sinh ra lượng lớn enzyme.

− Cũng với loài Aspergillus oryzae nuôi cấy trong hệ thống MSLC, Masakazu Morita et al. (2004) đã nghiên cứu vấn đề sử dụng nguồn nitơ trong sản xuất enzyme α-glucosidae.

Hình 2.1. Ảnh hưởng của việc sử dụng nguồn nitơ trong quá trình vận hành MSLC

Trong cả 2 trường hợp, việc sử dụng maltose và glucose cũng gần giống nhau. Nồng độ maltose giảm nhanh trong giai đoạn đầu và bằng 0 sau 5 ngày nuôi cấy. Nồng độ glucose tăng trong 2 hoặc 3 ngày đầu, và sau đó được vi sinh vật sử dụng đến cạn kiệt.

Nguồn YE làm pH giảm, nhưng khoảng dao động này là nhỏ, không đáng kể. Còn đối với nguồn NaNO3, pH tăng nhanh đến 8 sau 5 ngày nuôi cấy và vẫn có xu hướng tiếp tục tăng. Sự thay đổi này có thể làm ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật.

Sự phát triển tế bào khi sử dụng YE hay NaNO3 có khuynh hướng giống nhau, dù sau 5 ngày, hàm lượng chất khô tế bào có giảm nhiều hơn trong trường hợp sử dụng NaNO3. Tuy nhiên, lượng enzyme sản sinh sau 5 ngày nuôi cấy khi dùng NaNO3 chỉ đạt khoảng ½ so với khi sử dụng YE.

Vì vậy có thể kết luận được thành phần môi trường ảnh hưởng khá đáng kể đến sự sinh trưởng của tế bào vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp sản phẩm.

− Không chỉ vậy, trong vận hành MBRs, lưu lượng dòng chảy qua membrane cũng bị ảnh hưởng bởi các thành phần trong môi trường.

Lưu lượng dòng chảy qua membrane trong nghiên cứu này được W. Zhang (1998) mô tả qua hệ số dòng chảy Fi, được xác định là tỷ số giữa dòng chảy canh trường qua membrane trong suốt thời gian vận hành và dòng chảy ban đầu của nước sạch.

Sự ảnh hưởng của thành phần môi trường là glucose và YE đến hệ số Fi được biểu thị qua hình 2.2. qua hình 2.2.

Hình 2.2. Ảnh hưởng của YE và glucose trong môi trường

Trong trường hợp không có glucose, dòng chảy giảm không đáng kể từ giá trị YE 8.5 g/L trở đi. Trong khi đó, dòng chảy giảm đi 40% so với ban đầu ở giá trị glucose 100g/L và không có sự hiện diện của YE. Tuy nhiên, có thể quan sát được dòng chảy giảm gần 80% khi 100g/L glucose và 8.5g/L YE cùng tồn tại trong môi trường. Kết quả cho thấy có sự tác động qua lại giữa glucose và YE. Hiện tượng tắc nghẽn nghiêm trọng hơn khi các phân tử lớn hình thành do sự tác động của nguồn cơ chất này. Nagata et al. (1989) cũng đã nghiên cứu sự ảnh hưởng lẫn nhau của các thành phần trong môi trường, và có sự hình thành kết tủa kali amoni phosphate trong suốt quá trình tiệt trùng. Kết tủa này là chất gây tắc nghẽn chủ yếu trong việc thu nhận tế bào B. polymyxa bằng vi lọc. Sự ảnh hưởng và tác động qua lại giữa các thành phần môi trường gây ra việc tắc nghẽn được chú ý nhiều hơn trong các hệ thống nuôi cấy tế bào cố định trên membrane.

Việc thêm glucose trong lên men có hồi lưu ở hệ thống SMBR được quan tâm vì glucose làm tăng tốc độ sinh tổng hợp xylitol trong lên men tĩnh và fed batch. Khi glucose thêm vào, nồng độ sinh khối tăng đến 71g/L trong 3 chu kỳ hồi lưu. Tuy nhiên, sản phẩm xylitol do Candida tropicalis sản sinh chậm hơn trong pha đầu tiên ở mỗi chu kỳ, và tốc độ sinh tổng hợp xylitol cũng thấp hơn so với việc không sử dụng glucose.

Rất nhiều nghiên cứu đề cập đến việc bổ sung glucose vào môi trường trong phương pháp lên men có hồi lưu. Glucose là nguồn cơ chất khá phổ biến trong nhiều quá trình lên men. Nhìn chung, glucose có khuynh hướng gây tắc nghẽn membrane nghiêm trọng và ít được sử dụng quá trình vận hành MBRs (W. Zhang et al.1998).

− Trong sản xuất enzyme chitinase, chitin là nguồn cơ chất cảm ứng kích thích vi sinh vật

Paenibacillus sp. CHE-N1 sinh tổng hợp enzyme cảm ứng. Po-Min Kao et al. (2007) đã

khảo sát việc bổ sung chitin tại thời điểm 96h và 168h, liệu có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme chitinase hay không, kết quả thể hiện trên hình 2.3.

Hình 2.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung chitin đến chất lượng sản phẩm

Khi hoạt tính chitinase giảm dưới 13 mU/mL, người ta tiến hành bổ sung chitin. Bằng cách thay thế 500 mL canh trường với 500mL chitin (55.4g/L), hoạt tính chitinase trong canh trường giữ ổn định ở mức 13-15 mU/mL hơn 10 ngày. Điều này cho thấy khi chitin thêm vào, hoạt tính enzyem tăng tức thì. Sau đó, hoạt tính có thể thay đổi từ 15 xuống còn 13 mU/mL trong 3-4 ngày. Điều này có nghĩa rằng việc thêm chitin là cung cấp cho tế bào vi sinh vật một lượng môi trường mới để phát triển liên tục và sinh tổng hợp sản phẩm. − Một vài nghiên cứu đã cho rằng nồng độ lactate ở mức độ thấp ngoài việc có thể gây ức chế sự sinh tổng hợp sản phẩm ethanol, còn ức chế luôn cả sự sinh trưởng của

Sacharomyces cerevisiae. Hình 2.4 đã chỉ ra được ảnh hưởng của việc bổ sung acetate

Hình 2.4. Ảnh hưởng của tốc độ bổ sung cơ chất đến hiệu quả quá trình lên men ethanol. Bảng 2.4. Thành phần trong môi trường ở 3 giai đoạn

Cơ chất Glucose Galactose Lactose

Giai đoạn S4 (không bổ sung acetate) 66.5 71.5 3.7 Giai đoạn S5 (bổ sung acetate 5.8kg/m3) 77.1 81.5 5.3 Giai đoạn S6(bổ sung acetate 2.9 kg/m3) 74.4 78.2 4.9

(đơn vị: kg/m3)

Để giảm thiểu hiện tượng tắc nghẽn, sự phân cực trên màng và các vấn đề về bơm, tế bào được rút và giữ ổn định ở khoảng 160±25 kg/m3. Trạng thái cân bằng đầu tiên được thiết lập (ngoại trừ sự sinh trưởng của tế bào) và sử dụng nguồn cơ chất không có acetate (giai đoạn S4), kết quả thu được nồng độ ethanol là 63kg/m3 và hiệu suất là 15.1 kg/m3.h. Khi sử dụng nguồn cơ chất trong giai đoạn S5 có bổ sung 5.8kg/m3 acetate, sự sinh trưởng của tế bào vi sinh vật ngưng lại tức thời. Tuy nhiên, trong khi acetate không tác động đến việc sử dụng glucose nhưng lại có sự giảm mãnh liệt trong vấn đề sử dụng nguồn galactose, kết quả là lượng galactose sót giữ ở mức 40kg/m3. Sau đó, loại bỏ acetate từ nguồn cơ chất để trở về giống với trạng thái ban đầu, thời gian vận hành giai đoạn này từ giờ thứ 76 đến giờ thứ 136.

Trong giai đoạn S6, cơ chất chứa ½ lượng acetate so với giai đoạn S5. Tốc độ phát triển của vi sinh vật giảm đáng kể. Lượng đường tiêu thụ quan sát được là: sử dụng hoàn toàn lượng glucose nhưng không sử dụng hoàn toàn lượng galactose.

Như vậy, thấy được rằng việc bổ sung acetate ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men S. cerevisiae. Sự phát triển tế bào vi sinh vật giảm khi có mặt acetate 0.05M, và nó không ảnh hưởng đến việc sử dụng glucose sản sinh cồn. Tuy nhiên, acetate ảnh hưởng đến việc sử dụng galactose, và đây là điều không mong đợi trong hiện tượng sinh trưởng kép. Vẫn chưa có sự tối ưu hóa nào trong việc phối hợp giữa nồng độ acetate, tổng lượng đường và tốc độ pha loãng. Tuy nhiên, ở nghiên cứu này cũng đã cho thấy rằng nồng độ sản phẩm và hiệu suất thu được là thấp so với việc sử dụng nguồn nguyên liệu không có acetate.

Các ảnh hưởng đã nêu trên cho thấy tầm quan trọng trong việc sử dụng thành phần cơ chất như thế nào, với tỷ lệ là bao nhiêu để hợp lý. Rõ ràng thấy được rằng không phải cứ bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng vào là có lợi cho sự phát triển và sinh tổng hợp sản phẩm của vi sinh vật. Cần xem xét tối ưu hóa lại nguồn nguyên liệu trước khi thực hiện quá trình MBRs.

b. Vấn đề tiệt trùng môi trường

Môi trường trước lên men thường được tiệt trùng với mục đích tiêu diệt toàn bộ hệ vi sinh vật có trong nguyên liệu. Môi trường đã được tiệt trùng tác động hiệu quả hơn đến dòng chảy trong hệ thống MBRs. Hình 2.5 là ví dụ cụ thể.

Hình 2.5. Ảnh hưởng của dòng chảy trong MBRs trước và sau tiệt trùng

Môi trường lên men trong nghiên cứu này gồm có: 100g/L glucose, 8.5g/L YE, 1.3g/L NH4Cl, 0.12g/L MgSO4.7H2O, 0.06g/L CaCl2. Khảo sát được thực hiện trên membrane bất đẳng hướng. Điều kiện tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút.