Nồng độ glucose (%w/v)
Nồng độ casein (%w/v)
Hàm lượng protease (đơn vị hoạt độ/L) 0.05 0.2 0.5 0.5 0.5 1 1.5 0.4 0.4 0.1 0.4 1 0.4 0.4 900 1550 1350 1500 1250 1200 1100
Hàm lượng sản phẩm protease phụ thuộc vào nồng độ cả 2 chất. Đối với trường hợp 0.5% glucose, protease sản sinh là cao nhất khi nồng độ casein là 0.4%. Còn trong trường hợp nồng độ casein là 0.4% thì hàm lượng protease cực đại khi nồng độ glucose là 0.2%. Hàm lượng protease giảm khi tăng glucose lên 1 hay 1.5%, có thể vì glucose là lượng sử dụng chủ yếu để vi sinh vật sinh trưởng, chứ không phải sinh tổng hợp sản phẩm. Với 0.05% glucose và 0.4% casein, protease là thấp nhất do không đủ cơ chất cho nấm mốc sử dụng.
Có thể kết luận rằng nồng độ glucose ở mức thấp sẽ hiệu quả cho việc sinh tổng hợp enzyme, không những vậy, ở mức glucose thấp tương đối, nấm mốc có thể sử dụng nguồn năng lượng do trao đổi chất từ casein, từ đó có thể sản sinh ra lượng lớn enzyme.
− Cũng với loài Aspergillus oryzae nuôi cấy trong hệ thống MSLC, Masakazu Morita et al. (2004) đã nghiên cứu vấn đề sử dụng nguồn nitơ trong sản xuất enzyme α-glucosidae.
Hình 2.1. Ảnh hưởng của việc sử dụng nguồn nitơ trong quá trình vận hành MSLC
Trong cả 2 trường hợp, việc sử dụng maltose và glucose cũng gần giống nhau. Nồng độ maltose giảm nhanh trong giai đoạn đầu và bằng 0 sau 5 ngày nuôi cấy. Nồng độ glucose tăng trong 2 hoặc 3 ngày đầu, và sau đó được vi sinh vật sử dụng đến cạn kiệt.
Nguồn YE làm pH giảm, nhưng khoảng dao động này là nhỏ, không đáng kể. Còn đối với nguồn NaNO3, pH tăng nhanh đến 8 sau 5 ngày nuôi cấy và vẫn có xu hướng tiếp tục tăng. Sự thay đổi này có thể làm ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật.
Sự phát triển tế bào khi sử dụng YE hay NaNO3 có khuynh hướng giống nhau, dù sau 5 ngày, hàm lượng chất khô tế bào có giảm nhiều hơn trong trường hợp sử dụng NaNO3. Tuy nhiên, lượng enzyme sản sinh sau 5 ngày nuôi cấy khi dùng NaNO3 chỉ đạt khoảng ½ so với khi sử dụng YE.
Vì vậy có thể kết luận được thành phần môi trường ảnh hưởng khá đáng kể đến sự sinh trưởng của tế bào vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp sản phẩm.
− Không chỉ vậy, trong vận hành MBRs, lưu lượng dòng chảy qua membrane cũng bị ảnh hưởng bởi các thành phần trong môi trường.
Lưu lượng dòng chảy qua membrane trong nghiên cứu này được W. Zhang (1998) mô tả qua hệ số dòng chảy Fi, được xác định là tỷ số giữa dòng chảy canh trường qua membrane trong suốt thời gian vận hành và dòng chảy ban đầu của nước sạch.
Sự ảnh hưởng của thành phần môi trường là glucose và YE đến hệ số Fi được biểu thị qua hình 2.2. qua hình 2.2.
Hình 2.2. Ảnh hưởng của YE và glucose trong môi trường
Trong trường hợp không có glucose, dòng chảy giảm không đáng kể từ giá trị YE 8.5 g/L trở đi. Trong khi đó, dòng chảy giảm đi 40% so với ban đầu ở giá trị glucose 100g/L và không có sự hiện diện của YE. Tuy nhiên, có thể quan sát được dòng chảy giảm gần 80% khi 100g/L glucose và 8.5g/L YE cùng tồn tại trong môi trường. Kết quả cho thấy có sự tác động qua lại giữa glucose và YE. Hiện tượng tắc nghẽn nghiêm trọng hơn khi các phân tử lớn hình thành do sự tác động của nguồn cơ chất này. Nagata et al. (1989) cũng đã nghiên cứu sự ảnh hưởng lẫn nhau của các thành phần trong môi trường, và có sự hình thành kết tủa kali amoni phosphate trong suốt quá trình tiệt trùng. Kết tủa này là chất gây tắc nghẽn chủ yếu trong việc thu nhận tế bào B. polymyxa bằng vi lọc. Sự ảnh hưởng và tác động qua lại giữa các thành phần môi trường gây ra việc tắc nghẽn được chú ý nhiều hơn trong các hệ thống nuôi cấy tế bào cố định trên membrane.
Việc thêm glucose trong lên men có hồi lưu ở hệ thống SMBR được quan tâm vì glucose làm tăng tốc độ sinh tổng hợp xylitol trong lên men tĩnh và fed batch. Khi glucose thêm vào, nồng độ sinh khối tăng đến 71g/L trong 3 chu kỳ hồi lưu. Tuy nhiên, sản phẩm xylitol do Candida tropicalis sản sinh chậm hơn trong pha đầu tiên ở mỗi chu kỳ, và tốc độ sinh tổng hợp xylitol cũng thấp hơn so với việc không sử dụng glucose.
Rất nhiều nghiên cứu đề cập đến việc bổ sung glucose vào môi trường trong phương pháp lên men có hồi lưu. Glucose là nguồn cơ chất khá phổ biến trong nhiều quá trình lên men. Nhìn chung, glucose có khuynh hướng gây tắc nghẽn membrane nghiêm trọng và ít được sử dụng quá trình vận hành MBRs (W. Zhang et al.1998).
− Trong sản xuất enzyme chitinase, chitin là nguồn cơ chất cảm ứng kích thích vi sinh vật
Paenibacillus sp. CHE-N1 sinh tổng hợp enzyme cảm ứng. Po-Min Kao et al. (2007) đã
khảo sát việc bổ sung chitin tại thời điểm 96h và 168h, liệu có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme chitinase hay không, kết quả thể hiện trên hình 2.3.
Hình 2.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung chitin đến chất lượng sản phẩm
Khi hoạt tính chitinase giảm dưới 13 mU/mL, người ta tiến hành bổ sung chitin. Bằng cách thay thế 500 mL canh trường với 500mL chitin (55.4g/L), hoạt tính chitinase trong canh trường giữ ổn định ở mức 13-15 mU/mL hơn 10 ngày. Điều này cho thấy khi chitin thêm vào, hoạt tính enzyem tăng tức thì. Sau đó, hoạt tính có thể thay đổi từ 15 xuống còn 13 mU/mL trong 3-4 ngày. Điều này có nghĩa rằng việc thêm chitin là cung cấp cho tế bào vi sinh vật một lượng môi trường mới để phát triển liên tục và sinh tổng hợp sản phẩm. − Một vài nghiên cứu đã cho rằng nồng độ lactate ở mức độ thấp ngoài việc có thể gây ức chế sự sinh tổng hợp sản phẩm ethanol, còn ức chế luôn cả sự sinh trưởng của
Sacharomyces cerevisiae. Hình 2.4 đã chỉ ra được ảnh hưởng của việc bổ sung acetate
Hình 2.4. Ảnh hưởng của tốc độ bổ sung cơ chất đến hiệu quả quá trình lên men ethanol. Bảng 2.4. Thành phần trong môi trường ở 3 giai đoạn
Cơ chất Glucose Galactose Lactose
Giai đoạn S4 (không bổ sung acetate) 66.5 71.5 3.7 Giai đoạn S5 (bổ sung acetate 5.8kg/m3) 77.1 81.5 5.3 Giai đoạn S6(bổ sung acetate 2.9 kg/m3) 74.4 78.2 4.9
(đơn vị: kg/m3)
Để giảm thiểu hiện tượng tắc nghẽn, sự phân cực trên màng và các vấn đề về bơm, tế bào được rút và giữ ổn định ở khoảng 160±25 kg/m3. Trạng thái cân bằng đầu tiên được thiết lập (ngoại trừ sự sinh trưởng của tế bào) và sử dụng nguồn cơ chất không có acetate (giai đoạn S4), kết quả thu được nồng độ ethanol là 63kg/m3 và hiệu suất là 15.1 kg/m3.h. Khi sử dụng nguồn cơ chất trong giai đoạn S5 có bổ sung 5.8kg/m3 acetate, sự sinh trưởng của tế bào vi sinh vật ngưng lại tức thời. Tuy nhiên, trong khi acetate không tác động đến việc sử dụng glucose nhưng lại có sự giảm mãnh liệt trong vấn đề sử dụng nguồn galactose, kết quả là lượng galactose sót giữ ở mức 40kg/m3. Sau đó, loại bỏ acetate từ nguồn cơ chất để trở về giống với trạng thái ban đầu, thời gian vận hành giai đoạn này từ giờ thứ 76 đến giờ thứ 136.
Trong giai đoạn S6, cơ chất chứa ½ lượng acetate so với giai đoạn S5. Tốc độ phát triển của vi sinh vật giảm đáng kể. Lượng đường tiêu thụ quan sát được là: sử dụng hoàn toàn lượng glucose nhưng không sử dụng hoàn toàn lượng galactose.
Như vậy, thấy được rằng việc bổ sung acetate ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men S. cerevisiae. Sự phát triển tế bào vi sinh vật giảm khi có mặt acetate 0.05M, và nó không ảnh hưởng đến việc sử dụng glucose sản sinh cồn. Tuy nhiên, acetate ảnh hưởng đến việc sử dụng galactose, và đây là điều không mong đợi trong hiện tượng sinh trưởng kép. Vẫn chưa có sự tối ưu hóa nào trong việc phối hợp giữa nồng độ acetate, tổng lượng đường và tốc độ pha loãng. Tuy nhiên, ở nghiên cứu này cũng đã cho thấy rằng nồng độ sản phẩm và hiệu suất thu được là thấp so với việc sử dụng nguồn nguyên liệu không có acetate.
Các ảnh hưởng đã nêu trên cho thấy tầm quan trọng trong việc sử dụng thành phần cơ chất như thế nào, với tỷ lệ là bao nhiêu để hợp lý. Rõ ràng thấy được rằng không phải cứ bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng vào là có lợi cho sự phát triển và sinh tổng hợp sản phẩm của vi sinh vật. Cần xem xét tối ưu hóa lại nguồn nguyên liệu trước khi thực hiện quá trình MBRs.
b. Vấn đề tiệt trùng môi trường
Môi trường trước lên men thường được tiệt trùng với mục đích tiêu diệt toàn bộ hệ vi sinh vật có trong nguyên liệu. Môi trường đã được tiệt trùng tác động hiệu quả hơn đến dòng chảy trong hệ thống MBRs. Hình 2.5 là ví dụ cụ thể.
Hình 2.5. Ảnh hưởng của dòng chảy trong MBRs trước và sau tiệt trùng
Môi trường lên men trong nghiên cứu này gồm có: 100g/L glucose, 8.5g/L YE, 1.3g/L NH4Cl, 0.12g/L MgSO4.7H2O, 0.06g/L CaCl2. Khảo sát được thực hiện trên membrane bất đẳng hướng. Điều kiện tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút.
Nhận ra rằng dòng chảy của môi trường có qua tiệt trùng luôn cao hơn so với lúc chưa tiệt trùng, lưu lượng dòng gấp 1.8 lần ở trạng thái cân bằng. Điều này có thể do các phân tử nhỏ kết tụ lại thành nhưng phân tử lớn sau quá trình tiệt trùng làm membrane ít bị tắc nghẽn hơn, nên tốc độ dòng chảy qua màng sẽ cao hơn.
3. Điều kiện lên men
a. Ảnh hưởng của tốc độ pha loãng đến quá trình vận hành MBRs Khái niệm về tốc độ pha loãng (dilution rate – D) Khái niệm về tốc độ pha loãng (dilution rate – D)
Tốc độ pha loãng là một trong những thông số quan trọng trong quá trình. Nó quyết định đến sự tăng trưởng và tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm, không những thế, D còn làm ảnh hưởng đến sự tắc nghẽn trong membrane trong quá trình vận hành hệ thống.
D=F/V, với F là lưu lượng bơm cơ chất hay tháo sản phẩm (m3/h), V là thể tích sử dụng bình lên men (m3).
Vận hành MBRs liên tục thường ứng dụng phương pháp chemostat, tức là các nhà sản xuất mong muốn lưu lượng dòng vào bằng với lưu lượng dòng ra, nghĩa là cố định F, như vậy, hệ thống sẽ đơn giản và dễ điều khiển. Hơn thế nữa, hệ thống MBRs luôn đạt được giá trị nồng độ sinh khối cao, nên họ chỉ cần cố định giá trị D luôn nhỏ hơn tốc độ sinh trưởng riêng của vi sinh vật ở giai đoạn logarite.
Tốc độ pha loãng càng lớn thì năng suất hoạt động bình lên men càng cao. Tuy nhiên, D càng lớn sẽ gây ra hiện tượng tắc nghẽn membrane càng nghiêm trọng. Vì vậy, đối với hệ thống MBRs này, các nhà sản xuất cần phải tối ưu lại giá trị D.
− Mối quan hệ giữa D và nồng độ tế bào trong sản xuất vang khô từ glucose bằng hệ thống MBR hiệu năng cao bởi Sacharomyces cerevisiae WH-4 (Masamitsu Takaya et al. 2002) thể hiện trong hình 2.6.
Hình 2.6. Ảnh hưởng của tốc độ pha loãng đến nồng độ tế bào
Mối quan hệ này gần như tuyến tính, nghĩa là tốc độ pha loãng càng lớn thì nồng độ tế bào càng cao. Kết quả này chỉ ra rằng nồng độ tế bào liên quan mật thiết đến hiệu suất quá trình, và như vậy, muốn quá trình đạt hiệu quả, có thể điều chỉnh giá trị D phù hợp. Vì vậy có thể nói đặc tính của MBR rất hữu dụng để đạt được mật độ tế bào như mong muốn.
− S. Denis và P. Boyaval (1991) đã khảo sát quá trình vận hành dài trong MBR với membrane UF ở những giá trị tốc độ pha loãng khác nhau.
Hình 2.7. Sinh khối và hoạt tính sản phẩm enzyme trong dòng permeate khi thay đổi tốc độ pha loãng
Với D1=0.023h-1, D2=0.074h-1, D3=0.1h-1, D4=0.135 h-1, D5=0.09h-1
Sinh khối đạt đến 4.4 g/L sau 210h vận hành với số tế bào vi khuẩn sống khá cao. Ở mô hình này không thể đạt được trạng thái cân bằng thật sự. Sinh khối liên tục tăng, hơn nữa số tế bào chết được tập trung lại. Vì vậy, quan trọng là cần đưa các tế bào yếu ra ngoài, khi mà số tế bào sống giảm. Điều này cũng đã thể hiện trong Prigent et al. (1988). Quá trình liên tục được bắt đầu tại mức D=0.023h-1, sau khi kết thúc 26h lên men tĩnh. Tại thời điểm này, hoạt tính enzyme pectate lyase bắt đầu giảm, trong khi hoạt tính protease có phần tăng nhẹ. Sinh khối tăng 0.6g/L trong khi hoạt tính pectate lyase cứ tiếp tục giảm. Ta chú ý rằng việc tăng sản phẩm protease tại D=0.074h-1, nhưng mức độ chung sau giá trị tốc độ pha loãng này vẫn thấp, trong khoảng 0.1 đơn vị hoạt độ/mL.
Khảo sát trên bơm và điều kiện lên men kỵ khí cho phép ta hạn chế được việc giảm hoạt tính sinh học bởi mối nguy gãy vỡ. Hơn nữa, những thí nghiệm khác cũng chỉ ra rằng việc hấp thụ pectate lyase trên membrane không đáng kể trong suốt quá trình. Hiệu quả sinh tổng hợp protease là 0.09 đơn vị/mL.h trong lên men tĩnh và 0.18 đơn vị/mL.h tại thời điểm D=0.1h-1. Việc thay đổi D từ 0.1h-1 không thích hợp cho hiệu quả sinh tổng hợp protease. Tắc nghẽn trên membrane giảm cho phép các thành phần khối lượng phân tử lớn được giữ lại trong bioreactor. Phân tử khối của pectate lyase dao động trong khoảng 30- 45kDa, trong khi của protease ngoại bào dao động trong khoảng 50-55kDa. Các proteases này bị giữ lại ở lớp phân cực trên bề mặt membrane có thể gây nguy hiểm cho pectate lyases khi chúng đi qua màng.
− Tổng quát hơn, Munir Cheryan và Mohamed A. Mehaia (1983) đã khảo sát ảnh hưởng của tốc độ pha loãng đến hiệu quả quá trình trong sản xuất liên tục cồn từ đường lactose bởi loài vi sinh vật Kluyveromyces fragillis NRRL 2415 trong mô hình MRB hiệu năng cao, với module membrane dạng sợi rỗng. Kết quả thu được như hình 2.8.
Hình 2.8. Đánh giá hiệu quả quá trình lên men ethanol trong MRB theo tốc độ pha loãng
Kết quả đạt được tốc độ sinh tổng hợp ethanol cao, giá trị tối ưu là 65g/L.h tại giá trị tốc độ pha loãng là 7h-1. Tuy nhiên, kết quả này còn phụ thuộc vào nồng độ lactose cũng như hàm lượng sinh khối. Cụ thể cũng trong nghiên cứu này, khi nồng độ tế bào ban đầu đạt 90g/L thì tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm đạt cực đại ở giá trị 118g/L.h tại D=6h-1. Vì vậy, sự kết hợp của hàm lượng cơ chất và tốc độ pha loãng có thể phản ánh được hiệu quả quá trình vận hành MRB.
b. Cung cấp oxy cho nhóm vi sinh vật hiếu khí
Đối với môi trường lỏng, hàm lượng oxy cần cung cấp cho vi sinh vật trong quá trình lên men được xác định thông qua việc chọn áp lực của dòng khí vô trùng nén vào hệ thống sục khí và tốc độ cánh khuấy của thiết bị lên men.
B. Hammarberg et al. (1991) đã khảo sát ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy cũng như lưu lượng khí vào bình lên men trong việc thu nhận protein từ vi khuẩn Eschericha coli
trong mô hình MBR dạng ống có phun tia từ đỉnh bình lên men. Kết quả thể hiện trong hình 2.9.
Hình 2.9. Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến giá trị KLa
Trong sản xuất quy mô công nghiệp, đôi khi các thông số lên men đã được tối ưu hóa ở quy mô phòng thí nghiệm không còn thích hợp nữa, điều này thể hiện rõ qua vấn đề cung cấp oxy vào bình lên men. Chẳng hạn như đối với bình lên men 1 lít, lượng oxy hòa tan (DO) trong canh trường được đánh giá là phù hợp nhất trong điều kiện tốc độ khuấy là 500 rpm và không cần sục khí, nhưng áp dụng giá trị 500 rpm đó vào bồn lên men CSTR 500m3