Các thông số Lên men tĩnh Lên men có hồi lưu tế bào
Run 1 Run 2
Nồng độ tế bào ban đầu (g/L) Nồng độ tế bào kết thúc (g/L) Tổng xylose bổ sung (g) Tổng xylitol sinhra (g)
Tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm (g/Lh) Năng suất
Thời gian (h)
Thời gian 1 chu kỳ (h)
0.5 16.3 400 332 3.53 0.83 47 47 15.8 50.5 4298 3612 9.26 0.84 195 19.5 31.8 76 4280 3648 12 0.85 152 15.2
Trường hợp lên men có hồi lưu tế bào trong mô hình SMBR, tất cả tế bào được tái sử dụng, sinh khối có thể vẫn được giữ nguyên nồng độ hoặc tăng nồng độ lên gấp đôi sau quá trình lên men tĩnh (run 1 và run 2). Hiệu quả xylitol trong cả 2 trường hợp vẫn không giảm cho đến khi tế bào được hồi lưu hơn 10 chu kỳ. Nồng độ protein trong dịch lọc ở hệ thống SMBR được giữ ở dưới mức 0.04 mg/mL sau 10 chu kỳ hồi lưu, và không có hiện tượng tắc nghẽn trong suốt quá trình. Khi tăng số chu kỳ hồi lưu tế bào, thời gian lên men trong 1 chu kỳ giảm do nồng độ tế bào tăng. Trong mỗi chu kỳ hồi lưu, nồng độ xylitol trung bình là 180g/L, thời gian lên men 19.5h và hiệu suất 84%. Khi nồng độ tế bào ban đầu tăng gấp 2 lần, tốc độ sinh tổng hợp xylitol tăng từ 9.26 lên 12 g/L.h, và ở chu kỳ này, nồng độ xylitol là 182g/L, thời gian lên men 15.2h, và hiệu suất 85%. Ở trường hợp sau, 2000ml canh trường tế bào chuyển qua bình lọc và được cô đặc về 200ml trong 4 chu kỳ hồi lưu. Tuy nhiên, sau 5 chu kỳ hồi lưu, canh trường tế bào tăng lên khoảng 400ml do mật độ tế bào cao. Điều này làm tăng nhẹ hàm lượng sinh khối cũng như tăng hiệu suất sản phẩm sau 5 chu kỳ hồi lưu.
Như vậy, tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm tăng khoảng 3-4 lần và tổng hàm lượng xylitol tăng 11 lần so với lên men tĩnh trong lên men hồi lưu SMBR sử dụng nồng độ tế bào ban đầu cao gấp 2 lần. Hiệu suất tăng 2-4 lần, điều này cũng đã từng được Kim T.B. (2004) đề cập. Từ khi tế bào tái sử dụng cho chu kỳ kế, nồng độ tế bào ban đầu được giữ cao hơn hẳn trong SMBR so với lên men tĩnh. Sự chuyển hóa lượng lớn xylose chỉ trong một thời gian ngắn (ban đầu là khoảng 200g/L trong mỗi chu kỳ) vì sự tăng nồng độ tế bào ban đầu. Kết quả là hiệu suất tăng hơn 2% so với lên men tĩnh vì hàm lượng xylose sử dụng ít hơn cho sự phát triển tế bào. Năng suất từ đó cũng được cải thiện.
d. Kết luận
Quá trình lên men vận hành dài có hồi lưu tế bào để sản xuất xylitol trong SMBR với bơm chân không có thổi khí cho kết quả tốc độ sinh tổng hợp cao nhờ nồng độ tế bào cao. Không có sự tắc nghẽn hay nguy hiểm nào đối với tế bào trong suốt quá trình tập trung tế bào trong hồi lưu.
Kết quả này có ảnh hưởng lớn đối với việc sản xuất các sản phẩm xylitol thương mại bằng con đường vi sinh. Tuy nhiên, việc khảo sát mô hình SMBR với áp suất chân không và thổi khí chủ yếu chỉ để xử lý nước thải, chứ còn ứng dụng vào việc sản xuất các sản phẩm trao đổi chất vẫn chưa được thực hiện.
3. Sử dụng phương pháp tái tổ hợp gen trong sản xuất xylitol bằng mô hình MRB bởi nấm men Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae không thể sử dụng được đường xylose là nguồn carbon, vì
nó không tiết ra enzyme chuyển hóa đường xylose. Vì vậy, người ta đã nghĩ cách nối gen chuyển hóa đường xylose (XR) của Pichia stiptitis CBS5766 vào nấm men S. cerevisiae
BJ3505 để loài nấm men này có thể sử dụng được đường xylose chuyển hóa thành xylitol trong mô hình MBR.
a. Mô hình thiết bị vẫn tương tự như của Luis F.F. Faria (2002)
Hình 3.16. Mô hình MBR sản xuất xylitol từ S. cerevisiae BJ3505/δXR
b. Phương pháp
− Vi sinh vật: S. cerevisiae BJ3505/δXR.
Việc tái tổ hợp gen nhờ plasmid δXR có chứa gen XR của P.stipitis CBS5766 dưới sự điều khiển của enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD). − Môi trường: xylose, YPD (YE, bactopeptone, glucose).
− Thông số kỹ thuật: nhiệt độ 300C, pH=5, lưu lượng khí 1vvm, tốc độ cánh khuấy 400rpm.
− Kỹ thuật fed batch được thực hiện khi nồng độ glucose cạn kiệt, dung dịch glucose bổ sung vào khoảng 600g/L và luôn giữ không đổi. Mô hình hồi lưu tế bào tiền hành với 4 chu kỳ, người ta điều chỉnh lượng xylose trong khoảng 20-40g/L, bằng cách tháo 100mL canh trường và thêm vào dung dịch xylose 200g/L. Sau đó, nguồn YE được khảo sát bằng việc cung cấp 600g/L xylose và 100g/L YE.
Bảng 3.7. Tóm tắt kết quả trong sản xuất xylitol bằng S. cerevisiae BJ3505/δXR
Phương pháp Tế bào (g/L) Xylitol (g/L) hợp xylitol (g/Lh)Tốc độ sinh tổng Ethanol cuối (g/L) (mU/mL)XR Tĩnh
Fed batch lặp lại Hồi lưu tế bào Hồi lưu tế bào có YE
9.52 13.3 15.2 22 20.1 50.5 67.1 116 0.62 0.9 1.23 2.34 0 4.8 12.5 0 47±6 37±15 57±6 90±10 Mô hình hồi lưu tế bào bắt đầu khi có sự giảm sinh khối đột ngột, dẫn đến giảm số tế bào nấm men. Sở dĩ có hiện tượng giảm này là do 10% canh trường nuôi cấy được loại bỏ, thay vào đó là việc bổ sung thêm dung dịch xylose mới. Vì vậy, cần thiết phải giữ nồng độ tế bào ở mức cao trong bioreactor để tế bào nấm men luôn có hoạt tính sinh học chuyển hóa xylose thành xylitol. Lên men hồi lưu tế bào sử dụng membrane sợi rỗng được thực hiện. Quá trình 4 chu kỳ hồi lưu tế bào, thực hiện trong trong môi trường YPD với nguồn carbon ban đầu là 39g/L xylose và 18g/L glucose. Dung dịch glucose thêm vào liên tục từ 10-45h, với tốc độ 2.7mL/h. Sau khi loại bỏ 100mL canh trường, 200 g/L xylose được bổ sung để điều khiển mức xylose giữa 20-40g/L. Sự sinh trưởng tế bào là cực đại mà không có hiện tượng giảm đột ngột như trong lên men fed batch. Kết quả là cho 15.2g/L nồng độ tế bào chất khô, nồng độ xylitol là 67.1g/L, và nồng độ ethanol là 12.5g/L.
S. ceravisiae nếu gặp môi trường thuận lợi sẽ chuyển hóa đường glucose thành ethanol
gây ức chế vi sinh vật. Để hạn chế vấn đề này, người ta sử dụng nồng độ xylose ban đầu là 83g/L, có bổ sung xylose và YE. Mô hình MRB với 100 ml YE được bổ sung vào nhằm tạo điều kiện cung cấp nguồn nitơ, thuận lợi hơn cho S. cerevisiae BJ3505/δXR chuyển hóa đường xylose thành xylitol như mong đợi của nhà sản xuất. Kết quả thu được trong trường hợp này là: 22g/L nồng độ chất khô tế bào và nồng độ xylitol đạt được 116g/L, ethanol hầu như không xuất hiện.
d. Kết luận
Việc chuyển gen XR từ P. stipitis vào S. ceravisiae cho phép sản xuất thành công xylitol trong cả lên men tĩnh, fed-batch cũng như hồi lưu tế bào, với hiệu suất chuyển hóa đường xylose có thể lên đến 100%. Trong phương pháp lên men có hồi lưu tế bào, nồng độ xylitol cuối cùng cao gấp 3.3 lần và tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm tăng gấp đôi so với lên men tĩnh. Hoạt tính enzyme có chứa gen XR là cao nhất - tăng gấp 1.6 lần so với việc không bổ sung YE trong mô hình lên men có hồi lưu. Kết quả này cho thấy việc cung cấp nguồn nitơ sẽ làm tăng hoạt tính trao đổi chất để phát triển tế bào cũng như tiêu thụ hợp lý nguồn carbon trong việc sinh tổng hợp sản phẩm xylitol.
KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ
Vấn đề phân tách vi sinh vật từ canh trường có thể được thực hiện bằng nhiều cách. Phương pháp ly tâm đạt được hiệu suất cao, nhưng quy trình của nó quá phức tạp, không mang lại hiệu quả kinh tế cũng như khó khăn trong điều kiện vô trùng. Quá trình thực hiện trên membrane khá đơn giản và tiết kiệm chi phí năng lượng.
Lên men trong membrane bioreactors là một phương pháp hiện đại được chú ý trong những năm trở lại đây, phương pháp này có nhiều tính chất vượt trội hẳn so với phương pháp lên men truyền thống. Sự kết hợp các đặc tính giữa membrane và xúc tác sinh học là một kỹ thuật quan trọng trong mô hình MBRs này. Hiệu suất của quá trình đạt được là rất cao do nồng độ tế bào vi sinh vật luôn giữ ở mức ổn định, bằng cách cố định hay hồi lưu tế bào.
Tuy nhiên, vấn đề nào cũng có hai mặt của nó, yêu cầu nồng độ sinh khối cao có thể đạt được, nhưng như vậy sẽ dẫn đến sự khuếch tán bị giới hạn, sự sinh trưởng tế bào hay hoạt tính trao đổi chất có thể giảm, gây ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình.
Tốc độ pha loãng D có quan hệ mật thiết với nồng độ tế bào, trong quá trình sử dụng MBRs, có thể giữ được D ở một giá trị khá cao, điều này thuận lợi cho lưu lượng dòng permeate, cũng như thuận lợi trong vấn đề thu nhận sản phẩm trao đổi chất. Tuy nhiên, nếu giá trị D vượt quá giới hạn tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của vi sinh vật, vi sinh vật tăng trưởng không kịp so với nguồn cơ chất được cung cấp, gây ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi tế bào cũng như tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm.
Hơn nữa, tuy nói là giá trị D cao tạo điều kiện cho chất lỏng chuyển động xoáy giúp tăng lưu lượng dòng permeate, nhưng lúc này, mật độ sinh khối trên membrane tăng đáng kể có thể dẫn đến nguy cơ membrane bị tắc nghẽn, khiến việc xử lý tắc nghẽn và làm sạch membrane là khá phức tạp và hao tốn.
MBRs đã được biết đến cách đây 30 năm, nhưng có thể nói cho đến giờ, việc ứng dụng mô hình này vào quy mô công nghiệp chủ yếu chỉ là xử lý nước thải trong công nghiệp, gia đình và đô thị (Yang et al. 2006), còn đối với lĩnh vực công nghệ sinh học và thực phẩm, MBRs vẫn còn nhiều hạn chế, phạm vi áp dụng của nó khá hạn hẹp, chủ yếu là trong sản xuất ethanol, acid hữu cơ, cacbohydrate, enzyme. Khó khăn khi ứng dụng MBRs vào công nghiệp có liên quan đến xúc tác sinh học, cụ thể như thời gian sống của vi sinh vật, sự bảo toàn hoạt tính hay cấu trúc là những điều cần thiết trong điều kiện vận hành với nồng độ cơ chất thấp và khả năng chống nhiễm vi sinh cao, tuy nhiên vấn đề này lại liên quan đến giá thành khi mở rộng quy mô. Hơn nữa, quá trình điều khiển phản ứng sinh học cũng như các thông số động học, sự mô phỏng máy tính và tối ưu hóa, tự động hóa còn nhiều khó khăn.
Vì vậy, để thiết kế hoàn chỉnh mô hình MBRs trên quy mô công nghiệp đối với lĩnh vực hóa nói chung cũng như lĩnh vực thực phẩm nói riêng, cần có nhiều nghiên cứu hơn để tối ưu hóa quá trình, phát huy mọi ưu điểm, đồng thời có khả năng xử lý tốt các thách thức đã đưa ra, làm sao cho mô hình này có thể được ứng dụng rộng rãi và thuận lợi trong thời gian sắp tới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Lê Văn Việt Mẫn, Công nghệ sản xuất các thực phẩm từ sữa và thức uống, tập 1:
Công nghệ sản xuất các thực phẩm từ sữa, NXBĐHQGTPHCM, 2004, 296p, p72-92,
175-180.
[2] Giorno L, De Bartolo L,Drioli E., Membrane bioreactors for biotechnology and medical applications. In: Bhattacharyya D, Butterfield DA, editors. New insights into membrane science and technology: polymeric and biofunctional membranes. Elsevier; 2003. Chap 9.
[3] Munir Cheryan Ph.D, Ultrafiltration and Microfiltration handbook, A Technomic Publishing Company Book, 1998, 527p.
[4] Akinori Ogawa, Akinori Yasuhara, Takaaki Tanaka, Takaharu Sakiyama, Kazuhiro Nakanishi, Production of Neutral Protease by Membrane-Surface Liquid Culture of Aspergillus oryzae IAM 2704, Journal of Bioscience and Bioengineering Vol 80 No 1, 1995, p35-40.
[5] A.Krastanov, D. Blazheva, V. Stanchev, Sucrose conversion into palatinose with
immobilized Serratia plymuthica cells in a hollow – fibre bioreactors, Process
Biochemistry 42, 2007, p1655-1659.
[6] A.M. Ennis, I. S. Maddox, Production of solvents (ABE fermentation) from whey
permeate by continuous fermentation in a membrane bioreactor, Bioprocess
Engineering 4, 1989, p27-34.
[7] Anthony Patrick Andrew Taylor, Membrane bioreactor, Australian Nuclear Science and Technology Organisation 11, 2005.
[8] A.Olmos-Dichara, F. Ampe, J-L. Uribelarrea, A. Pateilleux, Growth & lactid acid
production by Lactobacillus casei ssp. rhamnosus in batch and membrane bioreactor: influence of yeast extract & Tryptone enrichment, Biotechnology Letters, Vol 19, No 8,
August 1997, p709-714.
[9] B.G. Park, W.G. Lee, Y. K. Chang, H. N. Chang, Long-term operation of continuous high cell density culture og Saccharomyces cerevisiae with membrane filtration and online cell concentration monitoring, Bioprocessing Engineering 21, 1999, p97-100. [10] B.Hammarberg,T. Nagamune, I. Endo, T. Moks, M. Uhlén, Utilizing the tubular
bioreactor for continuous recovery of secreted fusion protein from recombinant Escherichia coli, Bioprocess Engineering 7, 1991, p145-150.
[11] Catherine Charcosset, Membrane process in biotechnology: An overview, Biotechnology Advances 24, 2006, p482-492.
[12] Chukwu UN, Cheryan M, Electrodialysis of acetate fermentation broths. Appl Biochem Biotechnol,1999, 77–79: 485–499.
[13] Danner H, Madzingaidzo L, Hartl A, Braun R, Thermophilic fermentative production
of lactic acid from C5-sugars, Proceedings of the 10th European conference and
technology exhibition on biomass for energy and industry, 8–11 June 1998, Germany, p446–449.
[14] Daufin, G., Labbe, J. P., Quemerais, A., and Michel, F., Fouling of an inorganic
membrane during ultrafiltration of defatted whey protein concentrates, Neth. Milk
[15] Guo-qian Xu, Ju Chu, Yong-hong Wang, Ying-ping Zhuang, Si-liang Zhang, Hua- qiong Peng, Development of a continuous cell-recycle fermentation system for
production of lactic acid by lactobacillus paracasei, Process Biochemistry 41, 2006,
p2458-2463.
[16] H. Danner, L. Madzingaidzo, C. Thomasser, M. Neureiter, R. Braun, Thermophilic
production of lactic acid using integrated membrane bioreactor systems coupled with monopolar electrodialysis, Appl Microbiol Biotechnol 59, 2002, p160-169.
[17] Hélène Chèze-Lange, Denis Beunard, Pascal Dhulster, Didier Guillochon, Anne-Marie Cazé, Michel Morcellet, Nathalie Saude, Guy-Alain Junter, Production of microbial alginate in a membrane bioreactor, Enzyme and Microbial Technology 30, 2002, p656-661.
[18] H. Moueddeb, J. Sanchez, C. bardot, M. Fick, Membrane bioreactor for lactic acid
production, Journal of Membrane science 114, 1996, p59-71.
[19] Hoist O, Hansson L, Berg AC, Mattiasson B, Continuous culture with complete cell recycle to obtain high cell densities in product inhibited cultures: cultivation of Streptococcus lactis for production of superoxide dismutase, Appl Microbiol
Biotechnol 23, 1985, p10-14.
[20] Isabelle Daubert, Muriel Mercier-Bonin, Claude Maranges, Gérada Goma, Christian Fonade, Christine Lafforgue, Why and How Membrane Bioreactors with Unsteady
Filtration Conditions Can Improves the Efficiency of Biological Processes, New York
Academy of Sciences 984, 2003, p420-435.
[21] Kim, T. B., Lee, Y. J., Kim, P., Kim, C. S., and Oh, D. K., Increased xylitol production
rate during long-term cell recycle fermentation of Candida tropicalis, Biotechnol.
Letters 26, 2004, p623–627.
[22] Levente L. Diosady and Taya Puzanov, Membrane fermentation of acid lactic, International Journal of Applied Science and Engineering 3-1, 2005, p19-25.
[23] L.F.F. Faria, Xylitol production from xylose in a membrane bioreactor, PhD Thesis, COPPE, Federal University of Rio de Janeiro, 2000.
[24] Liu Zhaohui, Zhang Kuishan, Xin Feng, Present status and qpplications of membrane
bioreactors, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University,
2004, Vol 6 No 1.
[25] Luis F. Figueiredo Faria, Nei Pereira Jr., Ronald0 Nobrega, Xylitol production from D- xylose in a membrane bioreactor, Desalination 149, 2002, p231-236.
[26] Masakazu Morita, Hiroko Shimamura, Natsuko Ishida, Koreyoshi Imamura, Takaharu Sakiyama, Kazuhiro Nakanishi, Characteristics of α-glucosidase production from recombinant Aspergillus oryzae by Membrane-Surface Liquid Culture in comparision with various cultivation methods, Journal of Bioscience and Bioengineering Vol 98 No 3, 2004, p200-206.
[27] Masayuki Taniguchi, Takahiro Itaya, Toshihiro Tohma, Michihiro Fujii, Ethanol
Production from a Mixture of Glucose and Xylose by a Novel Co-Culture System with Two Fermentors and Two Microfiltration Modules, Journal of Fermentation and
[28] Masamitsu Takaya, Nobuya Matsumoto, Hideshi Yanase, Characterization of Membrane bioreactor for Dry wine production, Journal of Bioscience and Bioengineering, vol 93, no 2, 2002, p240-244.
[29] M.A.Mehaia và M. Cheryan, Ethanol from hydrolyzed whey permeate using Sacharomyces cerevisiae in a membrane recycle bioreactor, Bioprocessing Engineering 5, 1990, p57-61.
[30] Munir Cheryan and Mohamed A. Mehaia, A high-performance membrane bioreactor for continuous fermentation of lactose to ethanol, Biotechnology Letters Vol 5 No 8, 1983, p519-524.
[31] Muriel Mercier-Bonin, Isabelle Daubert, David Léonard, Claude Maranges, Chirstian Fonade, Christine Lafforgua, How unsteady filtration conditions can improve the process efficiency during cell cultures in membrane bioreactors, Separation Purification Technology 22-23, 2001, p601-605.
[32] Nagata N., Herouvis K.J, Dziewulski D.M, Belfort G., Cross flow membrane microfiltration of bacterial fermemtation broth, Biotechnol Bioengineering 34, 1989, p447-466.
[33] Po-Min Kao, Shu-Chen Huang, Yung-Chi Chang, Yung-Chuan Liu, Development of