b. Phương pháp thực hiện
− Vi sinh vật: Candida guilliermondii IM/UFRJ 50088
− Môi trường: 20g/L D-xylose, 1.1g/L K3PO4, 1.25g/L urea, 1.5g/L YE, 40mL/L dung dịch muối khoáng và acid citric. Môi trường được tiệt trùng 1100C trong 15 phút, có qua lọc bằng module membrane sợi rỗng 0.2μm.
− Các thông số kỹ thuật: nhiệt độ 300C, pH=6
− Bắt đầu là nuôi cấy tĩnh, đến khi nồng độ xylose giảm xuống còn 2g/L thì hệ thống được bổ sung xylose 50g/L liên tục, canh trường được liên tục tháo từ bình lên men với tốc độ bằng tốc độ nhập liệu. Sự hồi lưu tế bào được thực hiện bởi membrane UF dạng tấm 20kDa, cấu tạo bởi vật liệu ưa nước.
Hình 3.14. Động học quá trình chuyển hóa sinh học liên tục từ xylose thành xylitol bởi Candida guilliermondii trong hệ thống MBR.
Quá trình lên men tĩnh lúc đầu cho kết quả rất tốt. Lượng xylose được sử dụng toàn bộ sau 61h, dẫn đến nồng độ xylitol khá cao, là 48.5g/L và sinh khối đạt 16.3g/L. Quá trình liên tục bắt đầu khi hàm lượng xylitol giảm đột ngột. Khi D=0.05h-1, vi sinh vật đồng hóa và chuyển hóa lượng xylose thành xylitol không hiệu quả.
Sự phát triển của tế bào trong thiết bị khá ổn định, điều này phụ thuộc chủ yếu vào sự hồi lưu tế bào và tốc độ chuyển hóa oxy. Sự sinh trưởng có khuynh hướng giảm do tốc độ tiêu thụ oxy riêng của vi sinh vật giảm, do việc tăng nồng độ tế bào. Nồng độ xylose và xylitol có khuynh hướng ổn định sau 30h.
Sau 146h hoạt động, thực hiện loại bỏ nhanh vi sinh vật tạp nhiễm và thay đổi tốc độ dòng nhập liệu (D=0.07h-1), kết quả là sự sinh trưởng của tế bào giảm đồng thời với việc giảm nồng độ xylitol và tăng hàm lượng xylose.
Kết quả được thống kê ở bảng 3.5
Bảng 3.5. Thống kê các giá trị thu được trong quá trình lên men liên tục ở các tốc độ pha loãng khác nhau trong vận hành MBR
Theo bảng 3.5, khi D nhỏ hơn 0.05h-1, dòng permeate thu được với lượng xylose khá nhỏ, đồng thời hiệu suất và tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm là tối ưu. Khi bắt đầu thời điểm vận hành liên tục ở 0.03h-1, nồng độ xylitol giảm, giống như trong trường hợp D=0.05h-1, tuy nhiên điều này không quan trọng. Tốc độ pha loãng càng thấp thì việc chuyển hóa xylose thành xylitol càng hiệu quả. Cụ thể là ở giá trị D = 0.03h-1: sau 25h bổ sung cơ chất, quá trình lên men tự động đạt đến trạng thái cân bằng và ổn định trong 78h. Hiệu suất xylitol cao hơn 25% so với lên men tĩnh, độ chuyển hóa là 86%. Năng suất theo thể tích
Các thông số D=0.05h-1 D=0.07h-1 D=0.03h-1 D=0.02h-1
Tổng thời gian lên men (h) Hiệu suất sản phẩmYP/S
Hiệu suất sinh khốiYX/S
Hiệu suất riêng sản phẩm YP/X
Năng suất theo thể tích QPC
Năng suất riêng qPC
Xylose ở dòng permeate (g/L) Xylitol ở dòng permeate (g/L)
85 0.72 0.03 24 1.4 0.06 11.6 26.8 55 0.59 0.05 11.8 1.12 0.06 23.3 16.4 102 0.79 0.036 21.9 1.14 0.05 2.5 38 62 0.44 0.084 5.24 0.44 0.02 0.1 22.1
tăng 21% và năng suất riêng được giữ ổn định. Hơn nữa, dòng permeate thu được giàu xylitol (38g/L) và nồng độ xylose giảm đáng kể (2.5g/L).
Tuy nhiên, khi giảm D xuống còn 0.02h-1, lượng sinh khối có thể tăng nhưng sản phẩm thu được là không hiệu quả, có thể do lượng xylose không đủ mức đòi hỏi tối thiểu của tế bào vi sinh vật. Kết quả là sau 62h lên men liên tục, hiệu suất sản phẩm giảm 45% và năng suất tính theo thể tích giảm 61% so với ở giá trị D trước đó (0.03h-1).
Tóm lại, hiệu suất và tốc độ sinh tổng hợp xylose thành xylitol tối ưu là 0.79g xylitol/g xylose và 1.14g xylitol/L.h tại giá trị D=0.03h-1, trạng thái cân bằng đạt được sau 25h và ổn định trong 78h.
d. Kết luận
Membrane UF 20kDa được sử dụng trong hồi lưu tế bào, và trong suốt trạng thái cân bằng, dòng permeate với mức độ tinh sạch cao - chứa 38g/L xylitol, 2.5g/L xylose và loại bỏ được các cấu tử có phân tử lượng lớn. Kết quả này đem lại sự khả quan trong vấn đề tinh sạch xylitol. Quá trình kết hợp giữa membrane và chuyển hóa sinh học cho hiệu quả kinh tế cao trong sản xuất xylitol theo con đường sinh học hiện nay.
2. Hệ thống submerged membrane bioreactor (SMRB)
Một trường hợp khác, Soun-Gyu Kwon et al. (2005) đã phát triển hệ thống MBR. Ông nhận định rằng MBR sử dụng lên men có hồi lưu là chưa đủ, không thích hợp cho điều kiện hiếu khí vì nguồn cung cấp oxy còn rất hạn chế.
Phương pháp này sử dụng MBR chìm với sự hút chân không và thổi khí đồng thời. Hiện nay, phương pháp này được sử dụng phổ biến trong xử lý nước thải. Thiết bị này hiệu quả hơn về mặt tiêu thụ năng lượng, quá trình lọc cũng như việc xử lý tắc nghẽn, hồi lưu tế bào và nuôi cấy hiếu khí.
Hình 3.15. Mô hình hệ thống SMBR trong chuyển hóa xylose thành xylitol bởi Candida tropicalis
Bình lên men với hệ thống membrane sợi rỗng (Quiz Stand bench top system QSM- 02S, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). Canh trường tế bào được chuyển qua hệ thống lọc bởi bơm chân không (Cole-Permer Instrument, Vernon Hills, IL, USA). Bơm chân không được điều khiển ở áp suất 0.9 bar để tập trung tế bào. Thiết bị membrane sợi rỗng với kích thước lỗ 0.4μm (Mitsubish Rayon, Tokyo).
b. Phương pháp thực hiện
− Vi sinh vật: Candida tropicalis KCTC 10457
− Môi trường lên men:100-350g/L xylose, 0-20g/L glucose, 5g/L YE, 5g/L urea, 5g/L KH2PO4, 0.2g/L MgSO4.7H2O.
− Các thông số: pH=6.5, nhiệt độ 300C, tốc độ cánh khuấy 400rpm trong pha sinh trưởng và 350 rpm trong pha sản phẩm, tốc độ khí là 1vvm.
− Khi nồng độ xylose trong bioreactor thấp hơn 10g/L, canh trường được đưa qua thiết bị membrane. Ở đây, tế bào được tập trung bởi membrane sợi rỗng, có dùng bơm chân không và bộ phận nén khí, dòng permeate được đưa ra ngoài.
− Sau khi hoàn thành lên men tĩnh với thể tích làm việc 4L, thể tích này sẽ giảm xuống còn 2L bằng cách điều chỉnh môi trường mới thêm vào, vì vậy nồng độ tế bào tăng lên gấp đôi. Tốc độ cánh khuấy cũng tăng gấp đôi là 400rpm. Thực hiện trong 10 chu kỳ hồi lưu.
c. Kết quả
Các thông số Lên men tĩnh Lên men có hồi lưu tế bào
Run 1 Run 2
Nồng độ tế bào ban đầu (g/L) Nồng độ tế bào kết thúc (g/L) Tổng xylose bổ sung (g) Tổng xylitol sinhra (g)
Tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm (g/Lh) Năng suất
Thời gian (h)
Thời gian 1 chu kỳ (h)
0.5 16.3 400 332 3.53 0.83 47 47 15.8 50.5 4298 3612 9.26 0.84 195 19.5 31.8 76 4280 3648 12 0.85 152 15.2
Trường hợp lên men có hồi lưu tế bào trong mô hình SMBR, tất cả tế bào được tái sử dụng, sinh khối có thể vẫn được giữ nguyên nồng độ hoặc tăng nồng độ lên gấp đôi sau quá trình lên men tĩnh (run 1 và run 2). Hiệu quả xylitol trong cả 2 trường hợp vẫn không giảm cho đến khi tế bào được hồi lưu hơn 10 chu kỳ. Nồng độ protein trong dịch lọc ở hệ thống SMBR được giữ ở dưới mức 0.04 mg/mL sau 10 chu kỳ hồi lưu, và không có hiện tượng tắc nghẽn trong suốt quá trình. Khi tăng số chu kỳ hồi lưu tế bào, thời gian lên men trong 1 chu kỳ giảm do nồng độ tế bào tăng. Trong mỗi chu kỳ hồi lưu, nồng độ xylitol trung bình là 180g/L, thời gian lên men 19.5h và hiệu suất 84%. Khi nồng độ tế bào ban đầu tăng gấp 2 lần, tốc độ sinh tổng hợp xylitol tăng từ 9.26 lên 12 g/L.h, và ở chu kỳ này, nồng độ xylitol là 182g/L, thời gian lên men 15.2h, và hiệu suất 85%. Ở trường hợp sau, 2000ml canh trường tế bào chuyển qua bình lọc và được cô đặc về 200ml trong 4 chu kỳ hồi lưu. Tuy nhiên, sau 5 chu kỳ hồi lưu, canh trường tế bào tăng lên khoảng 400ml do mật độ tế bào cao. Điều này làm tăng nhẹ hàm lượng sinh khối cũng như tăng hiệu suất sản phẩm sau 5 chu kỳ hồi lưu.
Như vậy, tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm tăng khoảng 3-4 lần và tổng hàm lượng xylitol tăng 11 lần so với lên men tĩnh trong lên men hồi lưu SMBR sử dụng nồng độ tế bào ban đầu cao gấp 2 lần. Hiệu suất tăng 2-4 lần, điều này cũng đã từng được Kim T.B. (2004) đề cập. Từ khi tế bào tái sử dụng cho chu kỳ kế, nồng độ tế bào ban đầu được giữ cao hơn hẳn trong SMBR so với lên men tĩnh. Sự chuyển hóa lượng lớn xylose chỉ trong một thời gian ngắn (ban đầu là khoảng 200g/L trong mỗi chu kỳ) vì sự tăng nồng độ tế bào ban đầu. Kết quả là hiệu suất tăng hơn 2% so với lên men tĩnh vì hàm lượng xylose sử dụng ít hơn cho sự phát triển tế bào. Năng suất từ đó cũng được cải thiện.
d. Kết luận
Quá trình lên men vận hành dài có hồi lưu tế bào để sản xuất xylitol trong SMBR với bơm chân không có thổi khí cho kết quả tốc độ sinh tổng hợp cao nhờ nồng độ tế bào cao. Không có sự tắc nghẽn hay nguy hiểm nào đối với tế bào trong suốt quá trình tập trung tế bào trong hồi lưu.
Kết quả này có ảnh hưởng lớn đối với việc sản xuất các sản phẩm xylitol thương mại bằng con đường vi sinh. Tuy nhiên, việc khảo sát mô hình SMBR với áp suất chân không và thổi khí chủ yếu chỉ để xử lý nước thải, chứ còn ứng dụng vào việc sản xuất các sản phẩm trao đổi chất vẫn chưa được thực hiện.
3. Sử dụng phương pháp tái tổ hợp gen trong sản xuất xylitol bằng mô hình MRB bởi nấm men Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae không thể sử dụng được đường xylose là nguồn carbon, vì
nó không tiết ra enzyme chuyển hóa đường xylose. Vì vậy, người ta đã nghĩ cách nối gen chuyển hóa đường xylose (XR) của Pichia stiptitis CBS5766 vào nấm men S. cerevisiae
BJ3505 để loài nấm men này có thể sử dụng được đường xylose chuyển hóa thành xylitol trong mô hình MBR.
a. Mô hình thiết bị vẫn tương tự như của Luis F.F. Faria (2002)
Hình 3.16. Mô hình MBR sản xuất xylitol từ S. cerevisiae BJ3505/δXR
b. Phương pháp
− Vi sinh vật: S. cerevisiae BJ3505/δXR.
Việc tái tổ hợp gen nhờ plasmid δXR có chứa gen XR của P.stipitis CBS5766 dưới sự điều khiển của enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD). − Môi trường: xylose, YPD (YE, bactopeptone, glucose).
− Thông số kỹ thuật: nhiệt độ 300C, pH=5, lưu lượng khí 1vvm, tốc độ cánh khuấy 400rpm.
− Kỹ thuật fed batch được thực hiện khi nồng độ glucose cạn kiệt, dung dịch glucose bổ sung vào khoảng 600g/L và luôn giữ không đổi. Mô hình hồi lưu tế bào tiền hành với 4 chu kỳ, người ta điều chỉnh lượng xylose trong khoảng 20-40g/L, bằng cách tháo 100mL canh trường và thêm vào dung dịch xylose 200g/L. Sau đó, nguồn YE được khảo sát bằng việc cung cấp 600g/L xylose và 100g/L YE.
Bảng 3.7. Tóm tắt kết quả trong sản xuất xylitol bằng S. cerevisiae BJ3505/δXR
Phương pháp Tế bào (g/L) Xylitol (g/L) hợp xylitol (g/Lh)Tốc độ sinh tổng Ethanol cuối (g/L) (mU/mL)XR Tĩnh
Fed batch lặp lại Hồi lưu tế bào Hồi lưu tế bào có YE
9.52 13.3 15.2 22 20.1 50.5 67.1 116 0.62 0.9 1.23 2.34 0 4.8 12.5 0 47±6 37±15 57±6 90±10 Mô hình hồi lưu tế bào bắt đầu khi có sự giảm sinh khối đột ngột, dẫn đến giảm số tế bào nấm men. Sở dĩ có hiện tượng giảm này là do 10% canh trường nuôi cấy được loại bỏ, thay vào đó là việc bổ sung thêm dung dịch xylose mới. Vì vậy, cần thiết phải giữ nồng độ tế bào ở mức cao trong bioreactor để tế bào nấm men luôn có hoạt tính sinh học chuyển hóa xylose thành xylitol. Lên men hồi lưu tế bào sử dụng membrane sợi rỗng được thực hiện. Quá trình 4 chu kỳ hồi lưu tế bào, thực hiện trong trong môi trường YPD với nguồn carbon ban đầu là 39g/L xylose và 18g/L glucose. Dung dịch glucose thêm vào liên tục từ 10-45h, với tốc độ 2.7mL/h. Sau khi loại bỏ 100mL canh trường, 200 g/L xylose được bổ sung để điều khiển mức xylose giữa 20-40g/L. Sự sinh trưởng tế bào là cực đại mà không có hiện tượng giảm đột ngột như trong lên men fed batch. Kết quả là cho 15.2g/L nồng độ tế bào chất khô, nồng độ xylitol là 67.1g/L, và nồng độ ethanol là 12.5g/L.
S. ceravisiae nếu gặp môi trường thuận lợi sẽ chuyển hóa đường glucose thành ethanol
gây ức chế vi sinh vật. Để hạn chế vấn đề này, người ta sử dụng nồng độ xylose ban đầu là 83g/L, có bổ sung xylose và YE. Mô hình MRB với 100 ml YE được bổ sung vào nhằm tạo điều kiện cung cấp nguồn nitơ, thuận lợi hơn cho S. cerevisiae BJ3505/δXR chuyển hóa đường xylose thành xylitol như mong đợi của nhà sản xuất. Kết quả thu được trong trường hợp này là: 22g/L nồng độ chất khô tế bào và nồng độ xylitol đạt được 116g/L, ethanol hầu như không xuất hiện.
d. Kết luận
Việc chuyển gen XR từ P. stipitis vào S. ceravisiae cho phép sản xuất thành công xylitol trong cả lên men tĩnh, fed-batch cũng như hồi lưu tế bào, với hiệu suất chuyển hóa đường xylose có thể lên đến 100%. Trong phương pháp lên men có hồi lưu tế bào, nồng độ xylitol cuối cùng cao gấp 3.3 lần và tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm tăng gấp đôi so với lên men tĩnh. Hoạt tính enzyme có chứa gen XR là cao nhất - tăng gấp 1.6 lần so với việc không bổ sung YE trong mô hình lên men có hồi lưu. Kết quả này cho thấy việc cung cấp nguồn nitơ sẽ làm tăng hoạt tính trao đổi chất để phát triển tế bào cũng như tiêu thụ hợp lý nguồn carbon trong việc sinh tổng hợp sản phẩm xylitol.
KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ
Vấn đề phân tách vi sinh vật từ canh trường có thể được thực hiện bằng nhiều cách. Phương pháp ly tâm đạt được hiệu suất cao, nhưng quy trình của nó quá phức tạp, không mang lại hiệu quả kinh tế cũng như khó khăn trong điều kiện vô trùng. Quá trình thực hiện trên membrane khá đơn giản và tiết kiệm chi phí năng lượng.
Lên men trong membrane bioreactors là một phương pháp hiện đại được chú ý trong những năm trở lại đây, phương pháp này có nhiều tính chất vượt trội hẳn so với phương pháp lên men truyền thống. Sự kết hợp các đặc tính giữa membrane và xúc tác sinh học là một kỹ thuật quan trọng trong mô hình MBRs này. Hiệu suất của quá trình đạt được là rất cao do nồng độ tế bào vi sinh vật luôn giữ ở mức ổn định, bằng cách cố định hay hồi lưu tế bào.
Tuy nhiên, vấn đề nào cũng có hai mặt của nó, yêu cầu nồng độ sinh khối cao có thể đạt được, nhưng như vậy sẽ dẫn đến sự khuếch tán bị giới hạn, sự sinh trưởng tế bào hay hoạt tính trao đổi chất có thể giảm, gây ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình.
Tốc độ pha loãng D có quan hệ mật thiết với nồng độ tế bào, trong quá trình sử dụng MBRs, có thể giữ được D ở một giá trị khá cao, điều này thuận lợi cho lưu lượng dòng permeate, cũng như thuận lợi trong vấn đề thu nhận sản phẩm trao đổi chất. Tuy nhiên, nếu giá trị D vượt quá giới hạn tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của vi sinh vật, vi sinh vật tăng trưởng không kịp so với nguồn cơ chất được cung cấp, gây ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi tế bào cũng như tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm.
Hơn nữa, tuy nói là giá trị D cao tạo điều kiện cho chất lỏng chuyển động xoáy giúp tăng lưu lượng dòng permeate, nhưng lúc này, mật độ sinh khối trên membrane tăng đáng kể có thể dẫn đến nguy cơ membrane bị tắc nghẽn, khiến việc xử lý tắc nghẽn và làm sạch