Nhiệt độ gắn mồi
Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thƣờng hoạt động ở Tm thấp nhất + 3°C. Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thƣờng thấp hơn Tm thấp nhất, có thể dùng gradient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ƣu (khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thƣờng là 0.5°C). Đối với các primer có Tm cao hoặc tự bắt cặp, có cấu trúc vòng thì có thể khắc phục bằng PCR 2 bƣớc (95°C và 68°C).
Với cặp mồi KL1/LK2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nhiệt độ khác nhau từ 50°C đến 63°C, phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. Các phản ứng PCR đƣợc tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 50-63ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 50-63ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Sản phẩm sau phản ứng PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả. Kết quả điện di (hình 3.5) cho thấy, ở các nhiệt độ khác nhau phản ứng PCR cho kết quả khác nhau.
50 51 53 55 58 60 61 63 M
Hình 3.5. Ảnh diện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi KL1/KL2
Trên ảnh điện di ở nhiệt độ 55ºC cho kết quả PCR tốt nhất, băng sản phẩm PCR có độ sáng rõ và nét nhất. Còn ở các nhiệt độ khác thì hiệu quả của phản ứng PCR không đƣợc tốt thể hiện qua các băng của sản phẩm PCR có độ sáng mờ và không rõ nét. Từ kết quả của phản ứng PCR đƣợc thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau, phản ứng PCR đạt hiệu quả tốt nhất ở nhiệt độ gắn mồi 55oC.
Với cặp mồi KL5/LK6, phản ứng PCR cũng đƣợc thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau. Ban đầu chúng tôi tiến hành thử nghiệm trong dải nhiệt từ 50ºC đến 61ºC thu đƣợc kết quả các băng điện di chỉ xuất hiện từ nhiệt độ 54ºC trở đi. Tiếp đó chúng tôi thử nghiệm phản ứng trong dải nhiệt độ từ 54ºC đến 61ºC, phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. các phản ứng PCR đƣợc tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 54-61ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 54-61oC, 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Kết quả điện di (hình 3.6) cho thấy, ở nhiệt độ 59oC cho kết quả PCR tốt nhất, băng sản phẩm PCR có độ sáng rõ và gọn nét nhất. Vậy chúng tôi chọn hiệu quả gắn mồi tốt nhất ở nhiệt độ 59ºC.
61 60 59 58 57 56 55 54 M
Thời gian gắn mồi
Thời gian gắn mồi cũng đƣợc chuẩn hóa trong các phản ứng PCR.
Với cặp mồi KL5/KL6 thời gian gắn mồi thay đổi từ 20s, 30s, 40s 50s và 60s, phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. Chu trình nhiệt : 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC; 20s, 30s, 40s 50s hoặc 60s ở 590C; và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả điện di cho thấy hiệu quả gắn mồi tốt nhất là ở 60s (hình 3.7).
M NC 20s 30s 40s 50s 60s
Hình 3.7. Ảnh diện di kết quả tối ưu thời gian gắn mồi KL5/KL6
Với cặp mồi KL1/KL2 đầu tiên chúng tôi tiến hành thử nghiệm với thời gian gắn mồi thay đổi từ 20, 30, 40, 50 và 60s, kết quả không có sự khác biệt lớn các băng điện di ở 50 và 60s. Do vậy chúng tôi kiểm tra lại thử nghiệm trong thời gian 20s, 30s, 40s. Phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 20s, 30s, 40s ở 550C, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ và một bƣớc kéo dài trong 7 phút ở 72°C. Kết quả cho thấy hiệu quả gắn mồi ở 40s là nét nhất (hình 3.8). Do vậy, chúng tôi chọn thời gian gắn mồi cho KL1/KL2 là 40s trong phản ứng PCR thứ 2.
NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion) Hình 3.8. Ảnh diện di kết quả tối ưu thời gian gắn mồi KL1/KL2