Phản ứng hai vòng là một NAATs có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao. Tuy nhiên khả năng ngoại nhiễm cũng rất lớn. Để giảm thiểu nguy cơ ngoại nhiễm, chúng tôi sử dụng bốn phòng riêng biệt, một để pha mix, một để chuẩn bị mẫu và PCR lần 1, một tạo phản ứng PCR lần 2 và một phòng điện di. Trong các phản ứng chúng tôi sử dụng dUTP thay thế cho dCTP đồng thời sử dụng enzyme Uracyl-N-Glycosylase (UNG) nồng độ 0,05U. Enzyme này có tác dụng phân cắt các liên kết N- glycosylic giữa Uracyl và glucose của các sản phẩm ngoại nhiễm có chứa dUTP trong phản ứng thành các dUTP tự do, vô hiệu hoá amplicon nhiễm từ những đợt PCR trƣớc đó do vậy sẽ tránh đƣợc kết quả dƣơng tính giả. Do vậy, trƣớc khi thực hiện các chu kỳ khuếch đại trong chu trình PCR, cần ủ bệnh phẩm ở 37ºC trong 15 phút với enzyme UNG để phá các trình tự sản phẩm PCR nhiễm từ các đợt trƣớc. Các chu trình khuếch đại tiếp theo sẽ làm bất hoạt hoạt tính của UNG với nhiệt độ trên 55ºC. Sau khi chạy xong các chu
kỳ khuếch đại, ủ mẫu ở 72ºC trong thời gian 20 phút để bất hoạt hoàn toàn hoạt tính của UNG, không gây cản trở cho việc đọc kết quả PCR.
Kết quả dƣơng tính giả còn đƣợc loại trừ bằng một chứng âm thực hiện đồng thời với xét nghiệm trên mẫu nhƣng thay DNA khuôn bằng nƣớc khử ion vô trùng. Kết quả âm tính giả cũng đƣợc hạn chế đến mức thấp nhất vì phản ứng có độ nhạy cao, phát hiện đƣợc kết quả dƣơng tính khi có mặt 10 EB. Kết quả xét nghiệm trên mẫu bệnh phẩm đƣợc thể hiện ở hình 3.11.
NC 1 2 3 M 4 5
Hình 3.11. Kết quả xét nghiệm trên mẫu bệnh phẩm. NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion)
Giếng số 1,3,4: Mẫu bệnh phẩm dương tính Giếng số 2: Mẫu bệnh phẩm âm tính
Giếng số 5: Chứng dương
M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100 bp.
Tỷ lệ dƣơng tính C.trachomatis trong số bệnh nhân đến khám tại phòng khám Sản phụ khoa, bệnh viện Đại học Y Thái Bình thể hiện trong bảng 3.5.
PCR Số lượng Tỷ lệ phần trăm
Dƣơng tính 80 36.9 %
Âm tính 137 63.1 %
Tổng 217 100%
Trong số 217 bệnh nhân có biểu hiện viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011 có 80 ngƣời có kết quả dƣơng tính với C.trachomatis chiếm tỷ lệ 36.9%. Kết quả này cao hơn nghiên cứu của Trần Thị Lợi trên đối tƣợng viêm âm đạo, cổ tử cung năm 1999 có tỷ lệ 32.5% [8]; tại bệnh viện da liễu thành phố Hồ Chí Minh năm 2008 với xét nghiệm PCR tỷ lệ này là 35.7% [6]; tại bệnh viên phong da liễu Quy Hòa 12.1% [5]. Trong các nghiên cứu này tỷ lệ thấp nhất là tại bệnh viên phong da liễu Quy Hòa có thể do cỡ mẫu còn ít. Kết quả này cũng cao hơn nhiều so với nghiên cƣ́u của Farhad B. Hashemi và cô ̣ng sƣ̣ tại Iran năm 2006 [16]. Tuy nhiên một nghiên cứu ở Sóc Trăng trên đối tƣợng phụ nữ mại dâm tỷ lệ dƣơng tính với C.trachomatis là 48.4% [3], cao hơn nghiên cứu của chúng tôi.
Kết quả xét nghiệm trên chƣa phản ánh đƣợc toàn bộ quần thể vì còn có những đối tƣợng nhiễm bệnh nhƣng không có biểu hiện viêm nhiễm nên không đi khám, và xét nghiệm này lần đầu tiên đƣợc áp dụng tại Thái Bình. Vì vậy, với kết quả dƣơng tính cao nhƣ trên, chúng tôi đề xuất việc triển khai xét nghiệm vi khuẩn C.trachomatis
trong bệnh viện Đại học Y Thái Bình trên các đối tƣợng nữ có và không có biểu hiện viêm nhiễm sinh dục nhằm kiểm soát sự lây nhiễm vi khuẩn này qua đƣờng tình dục. Đồng thời chúng tôi đề nghị tiến hành nghiên cứu thêm trên cỡ mẫu lớn hơn để khẳng định kết quả.
Tiếp đó chúng tôi tiến hành thống kê số bệnh nhân theo nhóm tuổi. Kết quả thu đƣợc thể hiện trong bảng 3.6.
Bệnh nhân theo nhóm tuổi
Số mẫu dương
tính Tỷ lệ
<25 (n=32) 13 40.6%
25-35 (n=97) 35 36.1%
> 35 (n=88) 32 36.4%
Kết quả cho thấy nhóm dƣới 25 tuổi có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C.trachomatis cao nhất, chiếm 40.6%. Nghiên cứu của tác giả Bulhak Koziol V và cộng sự [33] tại một tỉnh của Balan cho thấy tỷ lệ dƣơng tính với vi khuẩn này là 39.5%, gần tƣơng đƣơng với kết quả của chúng tôi. Sự khác biệt về tỷ lệ dƣơng tính giữa nhóm dƣới 25 tuổi và trên 35 tuổi là có ý nghĩa thống kê với p<0.05. Tƣơng tự nhƣ vậy, sự khác biệt giữa nhóm dƣới 25 và từ 25- 35 tuổi cũng có ý nghĩa thống kê (p<0.05). Trong khi đó,khác biệt giữa nhóm 25- 35 tuổi và trên 35 tuổi không có ý nghĩa thống kê (p>0.05)
Trong số bệnh nhân dƣơng tính có những đối tƣợng chƣa kết hôn nhƣng đã quan hệ tình dục, nên khả năng bị dính tắc vòi trứng dẫn tới vô sinh, chửa ngoài tử cung khi lập gia đình là rất cao nếu không đƣợc phát hiện và điều trị kịp thời. Đặc biệt trong số này có cả sinh viên đại học và cao đẳng. Điều này cho thấy nhận thức về bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục nói chung và bệnh do C.trachomatis nói riêng chƣa đƣợc quan tâm nhiều trong giới trẻ tại Thái Bình. Chúng tôi đề xuất việc tuyên truyền nhận thức bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục do C.trachomatis cho giới trẻ tại Thái Bình trong thời gian tới.
Thống kê số bệnh nhân theo khu vực thành thị và nông thôn chúng tôi thu đƣợc kết quả theo bảng 3.7.
Bệnh nhân theo khu vực Số mẫu dương tính Tỷ lệ
Nông thôn (n=143) 54 37.8%
Thành thị (n=74) 26 35.1%
Bảng 3.7. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatistheo khu vực
Kết quả này cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C.trachomatis trong nghiên cứu tại Thái Bình ở nông thôn cao hơn ở thành phố, tỷ lệ khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0.05. Đồng thời chúng tôi thấy tỷ lệ bệnh nhân dƣơng tính tại nông thôn là 37.8% cao hơn nhiều so với nghiên cứu của Kirkwood và cộng sự tại Anh (1999) (tỷ lệ là 12.5%) [10]. Điều này có thể giải thích do số ngƣời khám bệnh đến từ nông thôn trong nghiên cứu của chúng tôi lớn hơn so với nghiên cứu trên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Qua tƣ vấn chúng tôi thấy phần lớn các phụ nữ đến khám đều không rõ vi khuẩn
C.trachomatis gây bệnh gì và để lại hậu quả ra sao nếu không điều trị kịp thời. Do vậy chúng tôi đề nghị tuyên truyền các thông tin liên quan đến bệnh tại tỉnh nhà để ngƣời dân đƣợc biết.
KẾT LUẬN
1. Đã chọn đƣợc các điều kiện tối ƣu cho phản ứng PCR về nhiệt độ gắn mồi, thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl2 và số chu kỳ tối ƣu nhất cho một phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn C.trachomatis.
2. Đánh giá đƣợc độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện đƣợc mẫu có chứa 10 thể cơ bản (EB) của vi khuẩn C.trachomatis.
3. Đánh giá đƣợc độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR đối với vi khuẩn C.trachomatis là 100%.
4. Xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở bệnh nhân có biểu hiện viêm âm đạo, cổ tử cung là 36.9%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Phạm Đông An (1996). Viêm nhiễm cổ tử cung do Chlamydia trachomatis ở phụ nữ mang thai, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ y khoa, Trung tâm đào tạo và bồi dƣỡng cán bộ y tế.
2. Bộ Y Tế (2007), “Vi sinh vật Y học”, Nhà xuất bản Y học.
3. Lê Hồng Cẩm (2002). Nghiên cứu tỷ lệ viêm cổ tử cung do Chlamydia trachomatis và một số yếu tố kết hợp ở phụ nữ trong lứa tuổi sinh đẻ tại huyện Hóc Môn, Luận án tiến sỹ y học, Đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh.
4. Phạm Văn Đức (2007). “ Tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatic ở phụ nữ hút thai ba tháng đầu thai kỳ và các yếu tố liên quan”, Tạp chí y học TP Hồ Chí Minh, tập 13 (1), trang 17-22.
5. Nguyễn Phúc Nhƣ Hà, “Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh phong và các bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục tại bệnh viện phong- da liễu Trung ƣơng Quy Hòa”. Bệnh viện phong- da liễu Trung ƣơng Quy Hòa.
6. Nguyễn Thanh Hùng, Nguyễn Trọng Hào, Nguyễn Ngọc Bá, “Giá trị chẩn đoán của test nhanh (quick test-USA) so với PCR (công ty Nam Khoa- Việt Nam) trong chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân đến khám tại bệnh viện Da liễu thành phố Hồ Chí Minh”. Bệnh viện Da liễu thành phố Hồ Chí Minh.
7. Trần Hậu Khang, Phạm Đăng Bảng, Lê Huyền My, viện Da liễu Quốc gia (2009), “Áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis
đƣờng sinh dục tiết niệu”, Tạp chí y học thực hành, 1, trang 641- 642.
8. Trần Thị Lợi (2000). “Sơ bộ khảo sát tình hành nhiễm Chlamydia trachomatis
trong viêm sinh dục “ Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, Tập 4 (1): trang 14-18 9. Đặng Chi Mai (2003). “ Chlamydiae”. Vi khuẩn học. Đại học Y dƣợc TP Hồ Chí
Minh, trang 176-176.
10. Nguyễn Văn Thục, “Dịch tễ học bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục và nhiễm HIV ở khu vực phía Nam Việt Nam: Một số vấn đề nổi cộm”. Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.
Tiếng Anh
11. Achchhe L Patel, Divya Sachdev, Poonam Nagpal, Uma Chaudhry, Subash C Sonkar, Suman L Mendiratta and Daman Saluja (2010), “Prevalence of Chlamydia infection among women visiting a gynaecology outpatient department: evaluation of an in-house PCR assay for detection of Chlamydia trachomatis”,Annals of clinical microbiology and antimicrobials, 9 (24),
12. Anahita Jenab, Naser Golbang, Pouran Golbang, Leili Chamani-Tabriz, M.PH, Rasoul Roghanian (2009), “Diagnostic Value of PCR and ELISA for Chlamydia trachomatis in a Group of Asymptomatic and Symptomatic Women in Isfahan, Iran”, Royan Institue International Journal of Fertility and Sterility Vol 2, (4), pp. 193-198.
13. Bass CA, Jungkind DL, Silverman NS (1993), “Clinical evaluation of a new polymerase chain reaction assay for detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens”. J Clin Microbiol; 31, pp. 2648-2653.
14. Boom R. et al., (1990), “Rapic and simple method for purification of nucleic acids”, J. Clin. Microbiol., vol. 28 no. 3, pp. 495-503.
15. European Centre for Disease prevention and Control (2008), Technical report review of Chlamydia control activities in EU countries, Stockholm.
16. Farhad B. Hashemi, BabakPourakbari, and JavadZaeimiYazdi (2007), “Frequency of Chlamydia trachomatis in Women with Cervicitis inTehran, Iran”,
Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology Vol 2007, 4 pp
17.Frost EH, Deslandes S, Bourgaux-Ramoisy D (1993), “Sensitive detection and typing of Chlamydia trachomatis using nested polymerase chain reaction”.
Genitour in Med, 69, pp 290-294. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
18. James B. Mahony, Kathleen E Luinstra, John W. Sellors, Dan Jang, and Max A. Chernesky (1992), “Confirmatory Polymerase Chain Reaction Testing for
Chlamydia trachomatis in First-Void Urine from Asymptomatic and Symptomatic Men”, Journal of clinical microbiology, pp. 2241-2245.
19. Joanne Rampersad, Xiaohui Wang, Helen Gayadeen, Samuel Ramsewak, and David Ammons (2007), “In-house polymerase chain reaction for affordable and sustainable Chlamydia trachomatis detection in Trinidad and Tobago”, Ammons Rev Panam Salud Publica, 22(5), pp. 317- 322.
20. J.S Wilson, E.Honey, A. Templeton, J.Paavonen, P.A. Mardh, A.Stary and B.Stray- Pedesen (2002), “A systematic review of the prevalence of Chlamydia trachomatis among European women”, Human Reproduction update, Vol 8, (4), pp. 385-394.
21. Loeffelholz MJ, Lewinski CA, Silver SR, (1992), “Detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens by polymerase chain reaction”. J. Clin Microbiol, 30, pp. 2847-2851.
22. Pamela Cribb, Juan Pablo Scapini, Esteban Serra (2002), “One-tube nested Polymerase Chain Reaction for detection of Chlamydia trachomatis”, Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 97(6), pp. 897-900.
23. Saiki RK et al., (1985), “Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia”,
Science, 230, pp. 1350-1354.
24. Nguyen Thi Thanh Thuy, Vo Tuyet Nhung, Nguyen Van Thuc, Truong Xuan Lien and Ha Ba Khiem (1998), “HIV infection and risk factors among female sex workers in southern Vietnam”, AIDS, 12, pp. 425-432.
25. Huynh Thi Trong, Nguyen Quoc Chinh and Nguyen Van Tu (2002), Prevalence of lower reproductive tract infections among married childbearing-age women in Ho Chi minh City.
26. Vietnam Commission for Population, Family and Children – Ministry of Health AIDS Division and Pasteur Institute Ho Chi Minh City. STI/HIV survey among female sex workers in 5 border provinces, Vietnam, 2002. Medical Publishing House, 2003.
Tài liệu tham khảo khác 27.www.cfsh.ca/files/PDF/chlamydia in canada.pdf 28.www.pasteur-hcm.org.vn/anpham/anpham.htm 29.www.pasteur-hcm.org.vn/anpham/dichtehoc_blqdtd.htm 30.www.quyhoandh.org.vn 31.www.hosrem.org.vn/index.php?...chlamydia...nhan 32.www.cicatelli.org/.../CHLAMYDIATESTINGTECHNOLOGIES012007.pdf 33.www.advms.pl/?q=system/files/30_52Bulhak-Koziol.pdf 34.http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Chlamydia_trachomatis 35. www.vsmmb.com/data/upload_file/File/.../PCR_basic.pdf