2.2.1. Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫu Phương pháp chọn mẫu
Tiêu chuẩn lựa chọn bê ̣nh nhân:
Bê ̣nh nhân trong đô ̣ tuổi sinh sản, đã tƣ̀ng quan hê ̣ tình du ̣c. Đƣợc khám và chẩn đoán là viêm âm đạo, cổ tƣ̉ cung. Đồng ý tham gia nghiên cƣ́u.
Tiêu chuẩn loại trừ:
Bê ̣nh nhân đang trong giai đoa ̣n kinh nguyê ̣t, bị rong kinh, rong huyết. Bê ̣nh nhân đã tƣ̀ng điều tri ̣ kháng sinh trong vòng 1 tháng trƣớc đó. Không đồng ý tham gia nghiên cƣ́u.
Nhƣ̃ng bê ̣nh nhân đƣợc lƣ̣a cho ̣n vào nghiên c ứu sẽ đƣợc lấy mẫu dịch ph ết cổ tƣ̉ cung để tiến hành làm xét nghiê ̣m PCR phát hiê ̣n Chlamydia trachomatis tại Trung tâm KHKT Y Dƣơ ̣c - Đa ̣i ho ̣c Y Thái Bình.
Cỡ mẫu:
Để xác đi ̣nh c ỡ mẫu cho việc ƣớc tính t ỷ lê ̣ nhiễm Chlamydia trachomatis ở nhƣ̃ng phu ̣ nƣ̃ viêm cổ tƣ̉ cung chúng tôi sƣ̉ du ̣ng công thƣ́c:
p p m n 1,96 1 2
Trong đó: n là cỡ mẫu, m là đô ̣ sai số, p là tỉ lê ̣ nhiễm Chlamydia trachomatis ở phụ nữ viêm cổ tử cung.
Với p = 17% (theo nghiên cƣ́u của Farhad B . Hashemi và cô ̣ng sƣ̣ [16]) và lựa chọn giá trị độ sai số m = 0,05 thì cỡ mẫu n tối thiểu là 217 bê ̣nh nhân.
2.2.2. Kỹ thuật xét nghiệm
2.2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Nhƣ̃ng bê ̣nh nhân đƣợc lƣ̣a cho ̣n tham g ia nghiên cƣ́u đều đƣợc thăm khám bởi các bác sĩ Sản phụ khoa để xác định tình trạng viêm âm đạo, cổ tƣ̉ cung trƣớc khi lấy mẫu. Dùng tăm bông lau sạch dịch tiết cổ tử cung. Dùng tăm bông tiếp theo đƣa sâu vào ống cổ tử cung 2 cm, xoay tăm bông và miết tăm bông vào thành ống cổ tử cung từ 15 đến 30 giây. Khi kéo tăm bông ra không chạm vào vách âm đạo. Mẫu phết cổ tử cung đƣơ ̣c giƣ̃ trong t uýp Falcol 15 ml có chƣ́a 2 ml dung di ̣ch 2SP (2-sucrose- phosphate transport medium ), bảo quản ở 4oC và đƣa về phòng thí nghiê ̣m trong vòng 2- 3 giờ và thực hiện phản ứng PCR trong vòng 24 giờ.
Tại phòng thí nghiệm, bệnh phẩm đƣợc chia nhỏ vào hai tuýp eppendorf 1.5 ml (1ml/tuýp), một tuýp đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng để tách chiết DNA , tuýp còn lại đƣợc bảo quản ở -70oC.
2.2.2.2. Xử lý mẫu
- Lấy 500 µl bệnh phẩm cho vào tuýp eppendorf 1.5 ml, bổ sung 500 µl dung dịch TTE, vortex, ly tâm 13.000 rmp/3 phút, loại dịch nổi, giữ lại khoảng 200 µl dịch đáy.
- Bổ sung 500 µl dung dịch PBS, vortex, ly tâm 13.000 rmp/3 phút, loại dịch nổi, giữ lại khoảng 200 µl dịch đáy.
2.2.2.3. Tách chiết ADN
Tuýp trên đƣợc sƣ̉ du ̣ng để tách chiết theo phƣơng pháp Boom [14]. Bƣớc 1: Phá tế bào giải phóng DNA
- Bổ sung 1000 µl dung dịch L6, vortex, bổ sung 30 µl SiO2, vortex đều, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn.
Bƣớc 2: Tinh sạch DNA
- Bổ sung 1000 µl dung dịch L2, vortex tan cặn, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn.
- Làm lại bƣớc trên.
- Bổ sung 1000 µl dung dịch ethanol 70% lạnh, vortex tan cặn, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn.
- Làm lại bƣớc trên.
- Bổ sung 1000 µl dung dịch acetone 100%, vortex tan cặn, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn.
- Làm khô cặn bằng cách sấy ở 60oC trong 10 phút, mở nắp eppendorf. Bƣớc 3: Thu hồi DNA
- Bổ sung 50 µl TE, ủ ở 60oC trong 10 phút, đóng nắp eppendorf. Ly tâm 13.000rmp/30s. Hút dịch nổi sang một eppendorf mới, ghi tên dán nhãn.
- Làm lại bƣớc trên.
Dịch nổi chứa DNA thu đƣợc bảo quản ở -20oC sử dụng chạy PCR. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2.4. Tối ưu hóa phản ứng PCR
Tại các phòng thí nghiệm khác nhau, phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên các máy luân nhiệt của các hãng khác nhau, đội ngũ cán bộ có trình độ khác nhau và sử dụng hoá chất của nhiều hãng. Vì vậy việc tối ƣu hoá phản ứng trong từng phòng thí
nghiệm là điều cần thiết để có một kết quả PCR chính xác, giảm thiểu sai sót và tránh lãng phí hoá chất không cần thiết.
Tại Lab sinh học phân tử - Trung tâm KHKT Y Dƣơ ̣c - Đa ̣i ho ̣c Y Thái Bình , phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Mastercycler C1000 của Biorad.
Thành phần phản ứng gồm: Master Mix (MgCl2, Taq polymerase, buffer), primer(reverse và foward), DNA khuôn. Chúng tôi sử dụng hai cặp mồi (theo khuyến cáo của CDC) để cho kết quả có độ chính xác cao.
Primer cho phản ứng PCR đầu tiên chúng tôi dùng cặp mồi KL5 và KL6 khuếch đại đoạn có kích thƣớc 288 bp trên cryptic plasmid của vi khuẩn Chlamydia trachomatis. Primer này có công thức nhƣ sau:
Tên mồi Trình tự 5’-3’ Kích thƣớc
KL5 TTTGCCTTAACCCCACCATT
288bp
KL6 CGTCCTTCCTAAAAGAGCTA
Primer cho phản ứng PCR thứ 2 chúng tôi dùng cặp mồi KL1 và KL2 khuếch đại đoạn có kích thƣớc 241 bp trên cryptic plasmid của vi khuẩn Chlamydia trachomatis, nằm trong đoạn 288 bp trên, với công thức nhƣ sau:
Tên mồi Trình tự 5’-3’ Kích thƣớc
KL1 TCCGGAGCGAGTTACTAAGA
241bp
KL2 AATCAATGCCCGGGATTGGT
Để tối ƣu hóa phản ứng chúng tôi tiến hành thử nghiệm PCR trong các nồng độ mồi khác nhau, nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl2, số chu kỳ thích hợp trong mỗi phản ứng. Trong mỗi phản ứng chúng tôi sử dụng enzyme UNG để khử các amplicon ngoại nhiễm.
Trong các thành phần buffer của phản ứng PCR, có lẽ ảnh hƣởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2. Việc tăng nồng độ MgCl2 quá cao làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu nhƣng nếu thiếu lại dẫn tới tình trạng lƣợng sản phẩm PCR thấp. Hơn nữa hóa chất do các hãng khác nhau cung cấp sẽ cho nồng độ MgCl2 thích hợp khác nhau, ở đây chúng tôi dùng MgCl2 nồng độ gốc 25 mM của Fermentas.
Với cặp mồi KL1/KL2, phản ứng PCR đƣợc thực hiện ở các nồng độ MgCl2 khác nhau để lựa chọn ra nồng độ thích hợp nhất nhằm làm tăng hiệu quả khuếch đa ̣i và độ đặc hiệu. Phản ứng đƣợc chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi loại mồi KL1 (5-TCCGGAGCGAG-TTACTAAGA-3) và KL2 (5- ATCAATGCCCGGGATTGGT- 3), 0.05 U UNG và nồng độ MgCl2 thay đổi từ 0.7 mM; 0.9 mM; 1.1 mM; 1.3 mM; 1.5 mM; 1.7 mM. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Tiếp đó chúng tôi tiến hành tối ƣu hóa nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL5/KL6. Phản ứng đƣợc chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi loại mồi KL5 (5-TTGCCTTAACCCCACCATT-3) và KL6 (5-CGT- CCTTCCTAAAAGAGCTA-3), 0.05 U UNG và nồng độ MgCl2 thay đổi từ 1.3 mM; 1.5 mM; 1.7 mM; 1.9 mM; 2.0 mM; 2.1 mM; 2.3 mM; 2.5 mM. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Nồng độ mồi
Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Trong phản ứng PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu của phản ứng, vì nếu đoạn mồi đƣợc chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp đƣợc trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và phản ứng PCR càng đặc hiệu. (2) Khởi động enzyme polymerase vì enzyme polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng đƣợc đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP đƣợc gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi.
Với cặp mồi KL5/KL6, phản ứng đƣợc chuẩn bị trong các nồng độ mồi khác nhau từ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 và 1 pmol/µl. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.Với cặp mồi KL1/KL2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nồng độ mồi khác nhau: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 pmol/µl, trong mỗi phản ứng có chứa 1 µl sản phẩm PCR lần 1. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút là 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Nhiệt độ gắn mồi
Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thƣờng hoạt động ở Tm thấp nhất + 3°C. Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thƣờng thấp hơn Tm thấp nhất, có thể dùng grandient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ƣu (khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thƣờng là 0.5- 1°C). Đối với các primer có Tm cao hoặc tự bắt cặp, có cấu trúc vòng thì có thể khắc phục bằng PCR 2 bƣớc (95°C và 68°C).
Với cặp mồi KL1/LK2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nhiệt độ khác nhau từ 50 đến 63ºC. Trong thể tích phản ứng 25 µl có 0.05 U UNG, các phản ứng PCR đƣợc tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 50-63ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 50- 63ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Với cặp mồi KL5/LK6, phản ứng PCR cũng đƣợc thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau từ 54 đến 610C. Trong thể tích phản ứng 25 µl, các loại mồi xuôi và mồi ngƣợc, 0.05 U UNG, các phản ứng PCR đƣợc tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 54-61ºC.Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 54-610C, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Thời gian gắn mồi:
Tùy theo kích thƣớc và tỷ lệ GC có trong mồi, thời gian gắn mồi thích hợp có thể khác nhau. Với hai cặp mồi KL1/KL2 và KL5/KL6 chúng tôi tiến hành phản ứng
PCR ở các thời gian gắn mồi khác nhau là: 20s, 30s, 40s, 50s và 60s. Phản ứng đƣợc chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; 0.05 U UNG, các mồi xuôi và mồi ngƣợc với thời gian gắn mồi thay đổi từ 20s, 30s, 40s, 50s và 60s. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 20s, 30s, 40s, 50s hoặc 60s ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số chu kỳ
Phản ứng PCR tiến hành với hai cặp mồi, trong đó số chu kỳ của từng phản ứng đƣợc thay đổi. Phản ứng đƣợc chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; các loại mồi.
Chu trình nhiệt của cặp mồi KL5/KL6: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C) trong 20, 25, 30 chu kỳ, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Chu trình nhiệt với cặp mồi KL1/KL2: biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 20, 25, 30 chu kỳ, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Số chu kỳ của từng phản ứng thể hiện trong bảng dƣới đây:
KL1/KL2 20 25 30
20 25 30
2.2.2.5. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR
Sử dụng mẫu DNA vi khuẩn C.trachomatis đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi KL5/KL6, đoạn DNA đƣợc khuếch đại có kích thƣớc 288 bp thuộc trình tự plasmid của vi khuẩn C.trachomatis. Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại đƣợc chèn vào vector pJet1.2/blunt (CloneJETTM
PCR Cloning kit - Fermentas) tạo plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp có mang đoạn DNA của vi khuẩn C.trachomatis đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli chủng Top 10F’nuôi qua đêm. Sau đó plasmid tái tổ hợp đƣợc tinh sạch bằng từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kít GeneJETTM plasmid miniprep kit –
Fermentas. Xác định nồng độ plasmid tái tổ hợp sau khi tinh sạch bằng cách đo khả năng hấp thụ bƣớc sóng 260nm trên máy Biophotometer (Eppendorf). Dựa vào nồng độ plasmid tái tổ hợp có thể tính đƣợc số bản sao plasmid trên một đơn vị thể tích theo công thức [35]:
N= (6.022*1023)*C/(650*109*3262)
Trong đó: 6.022*1023 là số bản copi plasmid trong 1 mole (định luật Avogadro) C là nồng độ plasmid (ng)
650 là khối lƣợng 1 mole của một cặp base (gr) = 650*109ng
3262 là chiều dài của plasmid (bao gồm plasmid có kích thƣớc 2974 bp và đoạn chèn kích thƣớc 288 bp).
Sau đó, mẫu plasmid tái tổ hợp có mang đoạn DNA của vi khuẩn C.trachomatis
đƣợc pha loãng thành các dung dịch có các nồng độ từ 1010, 109, 108, 107,... đến 101 bản sao plasmid/µl và sƣ̉ du ̣ng làm mẫu chuẩn để đánh giá đô ̣ nha ̣y của phản ƣ́ng.
Phản ứng PCR đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X và các loại mồi, 0.05 U UNG, thực hiện với mẫu chứng dƣơng plasmid có nồng độ khác nhau: 101
, 102, 103,104 bản sao/µl và sử dụng 10 µl để điện di trên gel agarose 1%. Chu trình nhiệt của cặp mồi KL5/KL6: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Chu trình nhiệt với cặp mồi KL1/KL2: biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
2.2.2.6. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng
Sƣ̉ du ̣ng các mẫu DNA có sẵn trong phòng thí nghiê ̣m để tiến hành phản ứng PCR kiểm tra xem có hiê ̣n tƣơ ̣ng phản ƣ́ng chéo xảy ra hay không . Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với các mẫu DNA của Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci và các mẫu DNA có sẵn trong phòng thí nghiệm nhƣ: mẫu DNA ngƣời, Escherichia coli, Mycobacteria tuberculosis, Hepatitis B virus, Human Papilloma virus.
2.2.2.7. Xác định tỷ lê ̣ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011 cung đến khám tại bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2011
Các mẫu bệnh phẩm thu thập đúng tiêu chuẩn chọn lựa sẽ đƣợc tiến hành phản ứng PCR theo quy trình chuẩn ở trên.
2.2.2.8. Điện di, phân tích kết quả
Chúng tôi sƣ̉ du ̣ng 10 µl sản phẩm phản ƣ́ng PCR để điê ̣n di trên gel agarose 1%, nhuộm gel trong dung di ̣ch ethidium bromide 0,5 µg/ml, chụp ảnh và phân tích kết quả.
- Chuẩn bị gel Agarose:
Hòa tan 1 g agarose trong 100 ml TBE 1X bằng lò vi sóng (2-3 phút). Để nguô ̣i agarose đến khoảng 50-60ºC rồi đổ vào khay đổ gel có cài sẵn răng lƣơ ̣c . Đợi khoảng 20-30 phút cho gel đông hoàn toàn mới đƣơ ̣c gỡ răng lƣơ ̣c ra.
- Điện di sản phẩm PCR
Sƣ̉ du ̣ng 10 l sản phẩm PCR và marker để cha ̣y điê ̣n di trong dung di ̣ch TBE
1X, hiệu điê ̣n thế 100 V với thời gian là 30 – 45 phút. Sau khi điê ̣n di xong , tiến hành nhuô ̣m bản gel trong dung di ̣ch ethidium bromide 0.5 g/ml tƣ̀ 5-10 phút. Rƣ̉a bản gel dƣới vòi nƣớc chảy trong vòng 30 giây.
- Chụp ảnh gel trên hệ thống UVP - Phân tích kết quả: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});