Chúng tôi sƣ̉ du ̣ng 10 µl sản phẩm phản ƣ́ng PCR để điê ̣n di trên gel agarose 1%, nhuộm gel trong dung di ̣ch ethidium bromide 0,5 µg/ml, chụp ảnh và phân tích kết quả.
- Chuẩn bị gel Agarose:
Hòa tan 1 g agarose trong 100 ml TBE 1X bằng lò vi sóng (2-3 phút). Để nguô ̣i agarose đến khoảng 50-60ºC rồi đổ vào khay đổ gel có cài sẵn răng lƣơ ̣c . Đợi khoảng 20-30 phút cho gel đông hoàn toàn mới đƣơ ̣c gỡ răng lƣơ ̣c ra.
- Điện di sản phẩm PCR
Sƣ̉ du ̣ng 10 l sản phẩm PCR và marker để cha ̣y điê ̣n di trong dung di ̣ch TBE
1X, hiệu điê ̣n thế 100 V với thời gian là 30 – 45 phút. Sau khi điê ̣n di xong , tiến hành nhuô ̣m bản gel trong dung di ̣ch ethidium bromide 0.5 g/ml tƣ̀ 5-10 phút. Rƣ̉a bản gel dƣới vòi nƣớc chảy trong vòng 30 giây.
- Chụp ảnh gel trên hệ thống UVP - Phân tích kết quả:
+ Mẫu chƣ́ ng dƣơng phải có va ̣ch DNA có kích thƣớc đúng khi so sánh vớ i thang DNA chuẩn (241 bp)
+ Mẫu chƣ́ ng âm phải không hiê ̣n va ̣ch DNA.
+ Mẫu bệnh phẩm dƣơng tính là mẫu có hiê ̣n va ̣ch DNA tƣơng đƣơng với va ̣ch DNA của mẫu chứng dƣơng.
+ Mẫu bệnh phẩm âm tính là mẫu không có va ̣ch DNA tƣơng đƣơ ng với mẫu chƣ́ng dƣơng.
2.2.3. Xử lý số liê ̣u
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm SPSS 11.5. Trong quá trình phân tích số liệu, chúng tôi sử dụng các test t-test, F-test để kiểm định ý nghĩa thống kê.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tối ƣu hó a phản ứng PCR phát hiện Chlamydia trachomatis
Tại các phòng thí nghiệm khác nhau, phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên các máy luân nhiệt của các hãng khác nhau, đội ngũ cán bộ có trình độ khác nhau và sử dụng hoá chất của nhiều hãng. Vì vậy việc tối ƣu hoá phản ứng trong từng phòng thí nghiệm là điều cần thiết để có một kết quả PCR chính xác, giảm thiểu sai sót và tránh lãng phí hoá chất không cần thiết.
Tại Lab sinh học phân tử - Trung tâm KHKT Y Dƣơ ̣c - Đa ̣i ho ̣c Y Thái Bình , phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Mastercycler C1000 của Biorad.
Để một phản ứng PCR đạt hiệu quả tốt trong thời gian ngắn nhất , chúng tôi thực hiện phản ứng PCR nhằm tối ƣu các điều kiện (nồng đô ̣ mồi, nhiê ̣t đô ̣ và thời gian gắn mồi, số chu kỳ lă ̣p la ̣i và nồng độ MgCl2) thích hợp đối với từng cặp mồi.
3.1.1. Nồng độ MgCl2
Trong các thành phần buffer của phản ứng PCR, có lẽ ảnh hƣởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2. Việc tăng nồng độ MgCl2 quá cao làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu nhƣng nếu thiếu lại dẫn tới tình trạng lƣợng sản phẩm PCR thấp. Hơn nữa hóa chất do các hãng khác nhau cung cấp sẽ cho nồng độ MgCl2
thích hợp khác nhau, ở đây chúng tôi dùng MgCl2 nồng độ gốc 25 mM của Fermentas. Để có đƣợc một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phản ứng rõ nét, ngƣời ta phải tối ƣu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một nồng độ MgCl2 thích hợp nhất. Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0.5-5 mM. Chính ion Mg2+ gắn liên kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám nối của mồi. Nồng độ MgCl2 cao sẽ tạo nhiều sản phẩm không đặc hiệu, nồng độ MgCl2 quá thấp sẽ không tạo sản phẩm PCR.
Với cặp mồi KL1/KL2, phản ứng PCR đƣợc thực hiện ở các nồng độ MgCl2 khác nhau để lựa chọn ra nồng độ thích hợp nhất nhằm làm tăng hiệu quả khuếch đa ̣i và độ đặc hiệu. Phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi mồi KL1 (5-TCCGGAGCGAG-TTACTAAGA-3)
và KL2 (5-ATCAATGCCCGGGATTGGT- 3), 0.05 U UNG và nồng độ MgCl2 thay đổi từ 0.7mM; 0.9mM; 1.1mM; 1.3mM; 1.5mM; 1.7mM. . Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả phản ứng đƣợc thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ MgCl2với cặp mồi KL1/KL2 M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100bp Giếng số 1 đến giếng số 6 nồng độ MgCl2 thay đổi từ 1,7 mM đến 0,7 mM
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (hình 3.1) cho thấy, ở các nồng độ MgCl2 khác nhau thì phản ứng PCR cho kết quả khác nhau. Ở nồng độ 1.5 mM và 1.7 mM cho kết quả nét nhất (giếng số 1 và giếng số 2) trong đó giếng số 2 cho băng gọn nét hơn. Từ kết quả này chúng tôi lựa chọn nồng độ MgCl2 là 1,5 mM cho các phản ứng PCR ứng dụng trong phát hiện sự có mặt của vi khuẩn C.trachomatis từ mẫu bệnh phẩm.
Tiếp đó chúng tôi tiến hành tối ƣu hóa nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL5/KL6. Phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi mồi KL5 (5-TTGCCTTAACCCCACCATT-3) và KL6 (5-CGT- CCTTCCTAAAAGAGCTA-3),0.05 U UNG và nồng độ MgCl2 thay đổi từ 1.3 mM; 1.5 mM; 1.7 mM; 1.9 mM; 2.0 mM; 2.1 mM; 2.3 mM; 2.5 mM. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở
1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 M
94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả thể hiện ở hình 3.2.
NC 1 2 3 4 5 6 7 8 M
Hình 3.2. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ MgCl2với cặp mồi KL5/KL6 NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion) Giếng số 1 đến số 8: nồng độ MgCl2 thay đổi từ 1,3 mM đến 2,5 mM M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100 bp
Trong hình trên chỉ có nồng độ 2.0 và 2.1 mM (giếng số 5 và số 6) là cho kết quả rõ nét nhƣng nét nhất là ở nồng độ 2.1 mM (giếng số 6). Vì vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ MgCl2 là 2.1 mM cho các phản ứng PCR ứng dụng trong phát hiện sự có mặt của vi khuẩn C.trachomatis từ mẫu bệnh phẩm khi sử dụng cặp mồi KL5/KL6.
3.1.2. Nồng độ mồi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi đƣợc chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp đƣợc trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu. (2) Khởi động enzyme polymerase vì enzyme polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng đƣợc đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP đƣợc gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi.
Với cặp mồi KL5/KL6, thành phần phản ứng đƣợc chuẩn bị có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl2; 0.05 U UNG, các nồng độ mồi khác nhau từ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 và 1 pmol/µl. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10
phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả điện di sản phẩm PCR thể hiện trên hình 3.3.
NC 1 2 3 4 5 M
Hình 3.3. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ mồiKL5/KL6 NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion)
Giếng số 1 đến số 8: sản phẩm PCR với nồng độ mồi thay đổi từ 0,2 đến 1 pmol M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100 bp
Trong các kết quả trên chỉ có giếng số 2 cho kết quả nét nhất tƣơng ứng với nồng độ 0.4 pmol/µl, vì vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ này cho phản ứng PCR.
Với cặp mồi KL1/KL2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nồng độ mồi khác nhau: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 pmol/µl, trong mỗi phản ứng có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl2, 1 µl sản phẩm PCR lần 1, 0.05 U UNG. Các phản ứng PCR đƣợc tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 50-60ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (hình 3.4) cho thấy: ở các nồng độ mồi khác nhau, phản ứng PCR cho các kết quả khác nhau.
Hình 3.4. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ mồiKL1/KL2
NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion)
Giếng số 1 đến số 4: sản phẩm PCR với nồng độ mồi thay đổi từ 0,1 đến 0,4 pmol M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100 bp
Nồng độ mồi 0.1 pmol/µl cho kết quả băng mờ và chƣa rõ nét. Ở nồng độ 0.2 pmol/µl trở lên các băng sản phẩm PCR rõ nét. Tuy nhiên phản ứng PCR ở nồng độ 0.4 pmol/µl sản phẩm sau điện di cho băng có độ sáng rõ nét nhất. Thử nghiệm phản ứng với các nồng độ mồi cao hơn chúng tôi thấy không có sự khác biệt lớn giữa các băng điện di. Từ các kết quả của phản ứng PCR trên các nồng độ mồi khác nhau, chúng tôi lựa chọn nồng độ mồi KL1/KL2 tốt nhất là 0.4 pmol/µl.
3.1.3. Thời gian và nhiệt độ gắn mồi
Nhiệt độ gắn mồi
Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thƣờng hoạt động ở Tm thấp nhất + 3°C. Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thƣờng thấp hơn Tm thấp nhất, có thể dùng gradient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ƣu (khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thƣờng là 0.5°C). Đối với các primer có Tm cao hoặc tự bắt cặp, có cấu trúc vòng thì có thể khắc phục bằng PCR 2 bƣớc (95°C và 68°C).
Với cặp mồi KL1/LK2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nhiệt độ khác nhau từ 50°C đến 63°C, phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. Các phản ứng PCR đƣợc tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 50-63ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 50-63ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Sản phẩm sau phản ứng PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả. Kết quả điện di (hình 3.5) cho thấy, ở các nhiệt độ khác nhau phản ứng PCR cho kết quả khác nhau.
50 51 53 55 58 60 61 63 M
Hình 3.5. Ảnh diện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi KL1/KL2
Trên ảnh điện di ở nhiệt độ 55ºC cho kết quả PCR tốt nhất, băng sản phẩm PCR có độ sáng rõ và nét nhất. Còn ở các nhiệt độ khác thì hiệu quả của phản ứng PCR không đƣợc tốt thể hiện qua các băng của sản phẩm PCR có độ sáng mờ và không rõ nét. Từ kết quả của phản ứng PCR đƣợc thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau, phản ứng PCR đạt hiệu quả tốt nhất ở nhiệt độ gắn mồi 55oC.
Với cặp mồi KL5/LK6, phản ứng PCR cũng đƣợc thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau. Ban đầu chúng tôi tiến hành thử nghiệm trong dải nhiệt từ 50ºC đến 61ºC thu đƣợc kết quả các băng điện di chỉ xuất hiện từ nhiệt độ 54ºC trở đi. Tiếp đó chúng tôi thử nghiệm phản ứng trong dải nhiệt độ từ 54ºC đến 61ºC, phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. các phản ứng PCR đƣợc tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 54-61ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 54-61oC, 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Kết quả điện di (hình 3.6) cho thấy, ở nhiệt độ 59oC cho kết quả PCR tốt nhất, băng sản phẩm PCR có độ sáng rõ và gọn nét nhất. Vậy chúng tôi chọn hiệu quả gắn mồi tốt nhất ở nhiệt độ 59ºC.
61 60 59 58 57 56 55 54 M
Thời gian gắn mồi
Thời gian gắn mồi cũng đƣợc chuẩn hóa trong các phản ứng PCR.
Với cặp mồi KL5/KL6 thời gian gắn mồi thay đổi từ 20s, 30s, 40s 50s và 60s, phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. Chu trình nhiệt : 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC; 20s, 30s, 40s 50s hoặc 60s ở 590C; và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả điện di cho thấy hiệu quả gắn mồi tốt nhất là ở 60s (hình 3.7).
M NC 20s 30s 40s 50s 60s
Hình 3.7. Ảnh diện di kết quả tối ưu thời gian gắn mồi KL5/KL6
Với cặp mồi KL1/KL2 đầu tiên chúng tôi tiến hành thử nghiệm với thời gian gắn mồi thay đổi từ 20, 30, 40, 50 và 60s, kết quả không có sự khác biệt lớn các băng điện di ở 50 và 60s. Do vậy chúng tôi kiểm tra lại thử nghiệm trong thời gian 20s, 30s, 40s. Phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 20s, 30s, 40s ở 550C, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ và một bƣớc kéo dài trong 7 phút ở 72°C. Kết quả cho thấy hiệu quả gắn mồi ở 40s là nét nhất (hình 3.8). Do vậy, chúng tôi chọn thời gian gắn mồi cho KL1/KL2 là 40s trong phản ứng PCR thứ 2.
NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion) Hình 3.8. Ảnh diện di kết quả tối ưu thời gian gắn mồi KL1/KL2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.4. Số chu kỳ
Phản ứng PCR tiến hành với hai cặp mồi, số chu kỳ với từng cặp mồi đƣợc thay đổi để thu đƣợc kết quả tốt trong thời gian ngắn nhất. Phản ứng PCR vòng 1 đƣợc tiến hành với số chu kỳ là 20, 25 và 30 chu kỳ. Với cặp mồi KL5/KL6, phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC; 1 phút ở 59ºC; và 1 phút ở 72°C) trong 20, 25, 30 chu kỳ, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.
Sau đó tiến hành phản ứng PCR vòng 2, phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 1 µl sản phẩm của phản ứng PCR vòng 1,0.05 U UNG theo từng chu kỳ trên. Chu trình nhiệt: biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 40s ở 55ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 20, 25, 30 chu kỳ và một bƣớc kéo dài trong 7 phút ở 72°C. Quan sát kết quả điện di trên hình 3.9.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
Hình 3.9. Ảnh diện di kết quả tối ưu chu kỳ phản ứng
Giếng số 1 đến giếng số 3: 20 chu kỳ PCR lần 1 và 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần 2 Giếng số 4 đến giếng số 6: 25 chu kỳ PCR lần 1 và 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần 2