Trong các thành phần buffer của phản ứng PCR, có lẽ ảnh hƣởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2. Việc tăng nồng độ MgCl2 quá cao làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu nhƣng nếu thiếu lại dẫn tới tình trạng lƣợng sản phẩm PCR thấp. Hơn nữa hóa chất do các hãng khác nhau cung cấp sẽ cho nồng độ MgCl2
thích hợp khác nhau, ở đây chúng tôi dùng MgCl2 nồng độ gốc 25 mM của Fermentas. Để có đƣợc một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phản ứng rõ nét, ngƣời ta phải tối ƣu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một nồng độ MgCl2 thích hợp nhất. Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0.5-5 mM. Chính ion Mg2+ gắn liên kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám nối của mồi. Nồng độ MgCl2 cao sẽ tạo nhiều sản phẩm không đặc hiệu, nồng độ MgCl2 quá thấp sẽ không tạo sản phẩm PCR.
Với cặp mồi KL1/KL2, phản ứng PCR đƣợc thực hiện ở các nồng độ MgCl2 khác nhau để lựa chọn ra nồng độ thích hợp nhất nhằm làm tăng hiệu quả khuếch đa ̣i và độ đặc hiệu. Phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi mồi KL1 (5-TCCGGAGCGAG-TTACTAAGA-3)
và KL2 (5-ATCAATGCCCGGGATTGGT- 3), 0.05 U UNG và nồng độ MgCl2 thay đổi từ 0.7mM; 0.9mM; 1.1mM; 1.3mM; 1.5mM; 1.7mM. . Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả phản ứng đƣợc thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ MgCl2với cặp mồi KL1/KL2 M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100bp Giếng số 1 đến giếng số 6 nồng độ MgCl2 thay đổi từ 1,7 mM đến 0,7 mM
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (hình 3.1) cho thấy, ở các nồng độ MgCl2 khác nhau thì phản ứng PCR cho kết quả khác nhau. Ở nồng độ 1.5 mM và 1.7 mM cho kết quả nét nhất (giếng số 1 và giếng số 2) trong đó giếng số 2 cho băng gọn nét hơn. Từ kết quả này chúng tôi lựa chọn nồng độ MgCl2 là 1,5 mM cho các phản ứng PCR ứng dụng trong phát hiện sự có mặt của vi khuẩn C.trachomatis từ mẫu bệnh phẩm.
Tiếp đó chúng tôi tiến hành tối ƣu hóa nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL5/KL6. Phản ứng đƣợc chuẩn bị trong một khối lƣợng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi mồi KL5 (5-TTGCCTTAACCCCACCATT-3) và KL6 (5-CGT- CCTTCCTAAAAGAGCTA-3),0.05 U UNG và nồng độ MgCl2 thay đổi từ 1.3 mM; 1.5 mM; 1.7 mM; 1.9 mM; 2.0 mM; 2.1 mM; 2.3 mM; 2.5 mM. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở
1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 M
94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bƣớc kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Kết quả thể hiện ở hình 3.2.
NC 1 2 3 4 5 6 7 8 M
Hình 3.2. Ảnh điện di kết quả tối ưu nồng độ MgCl2với cặp mồi KL5/KL6 NC: Chứng âm, không có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion) Giếng số 1 đến số 8: nồng độ MgCl2 thay đổi từ 1,3 mM đến 2,5 mM M: Thang DNA 100 bp của Fermentas với kích thước mỗi vạch là 100 bp
Trong hình trên chỉ có nồng độ 2.0 và 2.1 mM (giếng số 5 và số 6) là cho kết quả rõ nét nhƣng nét nhất là ở nồng độ 2.1 mM (giếng số 6). Vì vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ MgCl2 là 2.1 mM cho các phản ứng PCR ứng dụng trong phát hiện sự có mặt của vi khuẩn C.trachomatis từ mẫu bệnh phẩm khi sử dụng cặp mồi KL5/KL6.