Với mục đích xác định các SNP thuộc nhóm đơn bội O và C, chúng tôi đã tiến hành nhân các đoạn chứa các SNP cần phân tích. Theo tính toán lý thuyết các đoạn M175, P186, P191 và M216 có kích thƣớc lần lƣợt là 178 bp, 168, 177 bp và 160 bp. Kết quả cho thấy, chúng tôi đã nhân đƣợc các đoạn trình tự DNA mang các SNP với kích thƣớc tƣơng ứng với tính toán lý thuyết đƣợc trình bày trên hình 3.3.
53
Xác định các đa hình SNP
Các đa hình SNP trên từng chỉ thị đƣợc xác định cụ thể nhƣ trong hình 3.7.
A m175 TCTCTGATCA GGCACATGCC TTCTCACTTC TCTTCTCAAG AATGAACAGA AACAAAGGTA TCAGTAGAAA HH5 .......... .......... .......... ..---... .......... .......... .......... HS10 .......... .......... .......... ..---... .......... .......... .......... NSTY12 .......... .......... .......... ..---... .......... .......... .......... NSTY18 .......... .......... .......... ..---... .......... .......... .......... NSTY25 .......... .......... .......... ..---... .......... .......... .......... NSTY27 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... B P186 CCCAGTTGGA CCAGGGACAG GGCTCCTGAA ATTTTTCTGG GGAACCAAAA TCAGGGAAAA TTCTATTATT HH6 .......... .......... .......... ........ .....A.... .......... .......... TL92 .......... .......... .......... ........ .....A.... .......... .......... NSTY6 .......... .......... .......... ........ .......... .......... .......... NSTY15 .......... .......... .......... ........ .....A.... .......... .......... NSTY31 .......... .......... .......... ........ .....A.... .......... .......... C
P191 GTAGCAGAAA CCTTATTAAG AAAGGTATAG TGTTCAAAAT GTAACCTGTC TCCTACCACT CTTGGCTCCT HS2 .......... .......... .......... .......... ...G...... .......... .......... HS8 .......... .......... .......... .......... ...G...... .......... .......... NSTY17 .......... .......... .......... .......... ...G...... .......... .......... NSTY31 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... NSTY47 .......... .......... .......... .......... ...G...... .......... .......... D
m216 TTTTTATGAA GCTAGAAAAA AATTCCTTTA TTAAAGAAAT GTAACATTCA ACAGGTATAC ATAACTAGCA TL20 ........ ........ .......... .......... .......... .......... .......... TL62 ........ ........ .......... .......... .......... .......... .......... NSTY3 ........ ........ .......... .......... .......... .......... .......... NSTY20 ........ ........ .......... .......... ....T..... .......... .......... NSTY50 ........ ........ .......... .......... .......... .......... .......... Hình 3.7. So sánh trình tự các chỉ thị SNP
Trình tự của các đoạn chỉ thị SNP trên các mẫu nghiên cứu đƣợc so sánh với trình tự chuẩn tƣơng ứng của các chỉ thị lấy từ trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) [94] theo thứ tự sau: A: trình tự chứa chỉ thị SNP M175; B: trình tự chứa chỉ thị SNP P186; C: trình tự chứa chỉ thị SNP P191; D: trình tự chứa chỉ thị SNP M216.
Nhƣ vậy, chúng ta đã nhân đƣợc đúng đoạn DNA chỉ thị quan tâm và đã xác định đƣợc các vị trí đa hình nhƣ lý thuyết. Cụ thể là chỉ thị M175 có đa hình là – 5bp (±/TTCTC). Chỉ thị P186 có đa hình CA, chỉ thị P191 có đa hình là AG ở vị trí và chỉ thị M216 có đa hình CT. Thông tin cụ thể về đa hình của các mẫu nghiên cứu đƣợc thể hiện trên bảng 3.3.
Vị trí SNP (-5 bp)
Vị trí SNP Vị trí SNP
54
Bảng 3.3. Đa hình các chỉ thị SNP thuộc nhóm đơn bội O và nhóm đơn bội C của 68 mẫu cá thể nam ngƣời Mƣờng và ngƣời Katu.
Tên mẫu M175 P191 P186 M216 HH4 - G A - HH5 -5 bp G A - HH7 - G A - HS12 -5 bp G A - HS13 -5 bp G A - HS14 -5 bp G A - HS8 - G A - HS9 -5 bp G A - HH6 -5 bp G A - HS10 -5 bp G A - HS11 -5 bp G A - HS2 - G A - HS3 -5 bp G A - HS4 -5 bp G A - HS5 -5 bp G A - TL20 -5 bp G A - TL60 -5 bp G A - TL62 - G A - TL92 -5 bp G A - TL90 -5 bp G A - NSTY10 - G A - NSTY12 -5 bp G A - NSTY13 -5 bp G A - NSTY14 - G A - NSTY15 -5 bp G A - NSTY16 - G A - NSTY17 -5 bp G A - NSTY18 -5 bp G A - NSTY19 -5 bp G A -
55 NSTY1 -5 bp A A - NSTY20 - G A - NSTY21 -5 bp G A - NSTY22 -5 bp G A - NSTY23 - G A - NSTY24 -5 bp G A - NSTY25 -5 bp G A - NSTY26 -5 bp G A - NSTY27 - G A - NSTY28 - G A - NSTY29 -5 bp G A - NSTY2 -5 bp G A - NSTY30 -5 bp G A - NSTY31 -5 bp A A - NSTY32 -5 bp G A - NSTY33 -5 bp G A - NSTY34 -5 bp G A - NSTY35 -5 bp G A - NSTY36 -5 bp G A - NSTY37 -5 bp G A - NSTY38 -5 bp G A - NSTY39 - G A - NSTY3 -5 bp G A - NSTY40 - G A - NSTY41 - G A - NSTY42 - G A - NSTY43 -5 bp G A - NSTY44 -5 bp G A - NSTY45 -5 bp G A - NSTY46 -5 bp G A - NSTY47 -5 bp G A - NSTY48 -5 bp G A - NSTY4 -5 bp G A -
56 NSTY50 - A C T NSTY5 -5 bp G A - NSTY6 - A C - NSTY7 -5 bp G A - NSTY8 - G A - NSTY9 - G A - Số cá thể có đa hình 48 64 66 1 Tần suất 70.59 94.12 97.06 1.47
Ghi chú: (-) Đại diện cho nucleotide gốc
Kết quả xác định các SNP thuộc nhóm đơn bội O và C đƣợc liệt kê ở bảng 3.3 cho thấy, tất cả 4 chỉ thị đều xuất hiện đa hình trong các mẫu nghiên cứu. Trong đó, có 2 chỉ thị có mức độ đa hình rất lớn đó là P186 chiếm 97,06% số mẫu có đa hình và P191 có 94,12% đa hình là AG. Chỉ thị M175 ở hai dân tộc này cũng rất cao lên đến 70,6% trong khi đó chỉ thị duy nhất của nhóm đơn bội C là M216 có mức độ đa hình rất thấp, chỉ với 1 cá thể mang đa hình T chi ếm 1.47% đƣợc nhận diện trong các mẫu nghiên cứu.
Nhóm đơn bội O*-M175/P186/P191
Nhóm đơn bội O là dòng chủ đạo ở Đông và Đông Nam Á, bao gồm hơn 1/4 tất cả đàn ông trên thế giới với tần số xuất hiện trung bình trên toàn khu vực này lên đến trên 60% [83]. Theo phƣơng pháp phân loại nhóm đơn bội trên nhiễm sắc thể Y đã đƣợc đƣa ra năm 2002 [82] và đƣợc cập nhật lại năm 2008 [43] nhóm đơn bội O đƣợc xác định bằng 4 chỉ thị (M175, P186, P191 và P196 ). Cận nhóm O chỉ mang 1 trong 4 chỉ thị đã nêu ở trên, không mang các đa hình thuộc các nhánh phát sinh từ O. Từ những số liệu thu đƣợc cho thấy, có 48 cá thể mang các đa hình thuộc cận nhóm O-M175, 66 cá thể mang đa hình thuộc cận nhóm O-P186 và 64 thuộc cận nhóm O-P191 với tần số phân bố tƣơng ứng là 70,59%, 97,06% và 94,12 %. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi chƣa có điều kiện để phân tích toàn bộ các chỉ thị của các nhánh đƣợc sinh ra từ nhóm đơn bội O. Vì vậy những số liệu thống
57
kê trên đây có thể bị thay đổi khi có những phân tích đầy đủ về đa hình các thỉ thị của các nhánh thuộc nhóm đơn bội này.
Nhóm đơn bội O chiếm khoảng 80 đến 90% đàn ông ở Đông và Đông Nam Á và gần nhƣ không tìm thấy ở các nơi khác [91]. Chỉ thị M175 không xuất hiện ở Tây Siberia, Tây Á và châu Âu, đặc biệt là hoàn toàn không tìm thấy ở Châu Phi và Châu Mỹ, một số nhánh của nhóm đơn bội O xuất hiện với tần số tƣơng đối ở các bộ lạc ở Nam Á, các nhóm ngƣời thuộc nhóm ngôn ngữ Altaic ở Trung Á và các nhóm ngƣời thuộc nhóm ngôn ngữ Austronesia ở châu Đại Dƣơng [35; 42; 56; 64].
Hình 3.8. Bản đồ phân bố của nhóm đơn bội O trên thế giới [91]
Nhóm đơn bội O phân bố chủ yếu ở khu vực Châu Á Thái Bình Dƣơng và đảo Madagasca. Tần số phân bố của nhóm đơn bội này đƣợc miêu tả bằng mức độ đậm nhạt của màu xanh lá cây trong hình.
Nhóm đơn bội O đƣợc tách ra từ nhóm đơn bội NO (M214), nhóm đơn bội này có thể xuất hiện đầu tiên ở Siberia hoặc phía Đông của Trung Á khoảng 35 000 năm trƣớc. Thuộc nhóm đơn bội O, ngoài 3 nhánh O1, O2 và O3 còn có cận nhóm O*. Cận nhóm O* không mang các đa hình xác định các nhánh O1, O2 và O3. Cận nhóm này có tần số thấp ở ngƣời Trung và Đông Á hiện đại. Trong một điều tra tổng thể về đa hình nhiễm sắc thể Y ở các nhóm ngƣời sống trong khu vực trung đại lục Á-Âu, ngƣời ta đã tìm thấy nhóm đơn bội O* - M175 xuất hiện với tần số: 2,5%
58
(1/40 cá thể) ở ngƣời Tajik ở Samarkand, 4,5% (1/22) ở ngƣời Crimean Tatar sống ở Uzbekistan, 1,5% (1/68) ở ngƣời Uzbek sống ở Surkhandarya, 1,4% (1/70) ở ngƣời Uzbek sống ở Khorezm, 6,3% (1/16) của ngƣời Tajik sống ở Dushanbe, 1,9% (1/54) của ngƣời Kazakh sống ở Kazakhstan, 4,5% (2/41) của ngƣời Uyghur sống ở Kazakhstan và 31,1% (14/45) của ngƣời Triều Tiên.
Nhóm đơn bội C*-M216
Nhóm đơn bội C xuất hiện ngay sau khi loài ngƣời di cƣ ra ngoài châu Phi khoảng 50 nghìn năm trƣớc. Nhóm đơn bội này có thể theo con đƣờng từ Nam bán đảo Ả Rập qua Pakistan và Ấn Độ đến Sri Lanka, Đông Nam Á và Australia. Cận nhóm C* đƣợc tìm thấy ở Ấn Độ, Sri Lanka, một số nơi ở Đông Nam Á. C1 xuất hiện chủ yếu ở ngƣời Nhật Bản [30], trong khi đó C2 có tần số phân bố cao ở New Guinea, Melanesia, Polynesia. C3 có thể có nguồn gốc ở Đông Nam Á hoặc Trung Á, từ đó phân bố lên Bắc Á và di cƣ sang châu Mỹ.
Chỉ thị M216, cùng với 4 chỉ thị khác (RPS4Y711, P184, P255 và P260) xác định nhóm đơn bội C. Với tổng số cá thể là 68 đƣợc tiến hành phân tích, đã phát hiện đƣợc 1 cá thể có đa hình ở chỉ thị này, với tỷ lệ xuất hiện là 1,47%. Từ kết quả này cho thấy, C-M216 có tần số phân bố tƣơng đối thấp trong cộng đồng ngƣời Việt Nam. Tần số phân bố của nhóm đơn bội C-M216 ở một số dân tộc sống tại các tỉnh phía Nam của Trung Quốc (Quảng Đông và Quảng Tây) từ 2,9% ở ngƣời Biao cho đến 10% ở ngƣời Man-Caolan. Trong khi đó, tần số phân bố của nhóm đơn bội này ở một số dân tộc sống ở khu vực Đông Nam Á và một số vùng của châu Đại Dƣơng tƣơng đối cao, từ 7,7% ở ngƣời Bangka cho đến 45,5% ở ngƣời Irian.
Từ các dữ liệu của nghiên cứu này chúng ta có thể thấy: Với tần số xuất hiện rất lớn của các chỉ thị nhóm đơn bội O (từ trên 70% của chỉ thị M175 và trên 90% của chỉ thị P186 và p191) cùng với tỉ lệ xuất hiện rất nhỏ của chỉ thị nhóm C (1.47% của chỉ thị M216). Ngƣời Mƣờng và Ngƣời Katu có đặc điểm đa hình nhiễm sắc thể Y tƣơng đồng với các dân tộc khác trong khu vực Đông Á và đặc biệt là khu vực Đông Nam Á.
59
Hình 3.9. Bản đồ mô tả thuyết di cƣ của các quần thể theo phụ hệ vào Đông Á [93]. Bản đồ hiển thị các tuyến đƣờng di cƣ của ngƣời hiện đại đến Đông Á và sự phát tán đầu tiên trên lãnh thổ này.
Các quần thể ngƣời ở Đông Nam Á đƣợc ghi nhận là có độ đa dạng lớn của các nhóm và các phân nhóm đơn bội [91]. Qúa trình lịch sử hình thành và di cƣ của các nhóm đơn bội cũng rất phức tạp. Một số học thuyết cho rằng hai nhóm đơn bội C và D là những nhóm đầu tiên xuất hiện ở khu vực này và có khả năng hai nhóm này đã từng đạt đƣợc chỗ đứng trong khu vực này khoảng 45 000 năm trƣớc, trong thời kỳ đồ đá cũ trƣớc khi di cƣ lên phía bắc. Sau đó, khoảng 35 000 năm trƣớc, nhóm đơn bội O xuất hiện và phát triển rộng khắp khu vực Đông Á. Sự phát triển của nhóm đơn bội O đƣợc cho là do chúng xuất hiện và phát triển cùng với sự gia tăng dân số của loài ngƣời trong thời kỳ đồ đá mới khi con ngƣời bắt đầu phát triển các kỹ thuật nông nghiệp sơ khai [91].
60
Dựa vào bản đồ di cƣ của các nhóm đơn bội (hình 3.9) chúng ta có thể thấy: Việt Nam gần nhƣ nằm ở giao điểm giữa con đƣờng di cƣ của các nhóm và trong hình 3.8 thể hiện nƣớc ta nằm trong những vùng có tần số xuất hiện nhóm đơn bội
O lớn nhất. Cụ thể sự phân bố đƣợc mô tả trong hình 3.10.
Hình 3.10. Sự phân bố của các nhóm đơn bội Y ở Đông Á và khu vực xung quanh [93]. Nhóm đơn bội C và N chiếm ƣu thế ở phía Bắc lục địa. Các nhóm đơn bội P, R và J phổ biến ở phía Tây, và O ở khắp các khu vực phía Đông, Đông Nam và phía Nam. Nhóm đơn bội D phân bố ở Tây Tạng và Nhật Bản. Châu Đại Dƣơng là nơi cƣ trú chính của nhóm M. Nhóm đơn bội Q phân bố ở cực đông bắc nƣớc Nga.
3.5. CÁC ĐA HÌNH TRÊN DNA TY THỂ VÀ NHIỄM SẮC THỂ Y Ở CÁC CÁ THỂ NGƢỜI MƢỜNG VÀ NGƢỜI KATU
Bên cạnh số liệu đa hình của các chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y, các số liệu trên vùng điều khiển của DNA ty thể cũng thể hiện một kết quả tƣơng tự. Nhƣ thể hiện trong bảng 3.1 và trên cây phát sinh dựa trên DNA ty thể (hình 3.6) chúng ta các nhóm cá thể thuộc thấy hai dân tộc Mƣờng và Katu có mối quan hệ gần gũi với
61
nhau và với các dân tộc trong khu vực Đông Nam Á nhƣ Campuchia, Thái Lan, Malysia và những ngƣời Nam Á nhƣ Ấn Độ và Pakistan. Đặc điểm đa hình của các chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y cho thấy với tần xuất rất lớn (trên 90% của hai chỉ thị P186 và P191, trên 70% của chỉ thị M175) của các đa hình nhóm O vốn đặc trƣng cho tần xuất của nhóm đơn bội này trong khu vực. Nhƣ vậy, các đa hình trên DNA ty thể và nhiễm sắc thể Y ở các cá thể ngƣời Mƣờng và ngƣời Katu trong nghiên cứu này cũng cho một kết quả tƣơng tự với các kết quả nghiên cứu trƣớc đây về các đặc điểm đa hình này trên các dân tộc khác trong khu vực [6; 33; 59].
62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ các kết quả đã đạt đƣợc chúng tôi rút ra một số kết luận sau đây:
1. Đã tách chiết và tinh sạch đƣợc DNA tổng số từ mẫu máu của 108 mẫu cá thể ngƣời Việt Nam thuộc hai dân tộc Mƣờng và Katu sau đó nhân bản thành công vùng điều khiển D-loop (1121 bp) của DNA ty thể và các chỉ thị M175 (178 bp), P186 (168 bp), P191 (177 bp) và M216 (160 bp) trên nhiễm sắc thể Y bằng kỹ thuật PCR, sử dụng các cặp mồi tƣơng ứng.
2. Đã xác định đƣợc trình tự vùng điều khiển D-loop khoảng 1120 bp của 38 mẫu cá thể ngƣời Mƣờng, trình tự vùng HV1 của 41 mẫu cá thể ngƣời Katu và trình tự các đoạn chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y của 68 mẫu nam ngƣời Mƣờng và Katu. Phân tích trình tự, chúng tôi phát hiện thấy tổng cộng có 494 điểm sai khác trên vùng D-loop của các mẫu cá thể dân tộc Mƣờng và 187 điểm sai khác trên vùng HV1 của các mẫu cá thể ngƣời dân tộc Katu.
3. Bƣớc đầu xác định đƣợc khoảng cách di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự vùng HV1 của DNA ty thể giữa hai nhóm cá thể hai dân tộc Mƣờng và Katu với các dân tộc ở khu vực lân cận nhƣ ngƣời Thái Lan, ngƣời Campuchia, ngƣời Malaysia ….
4. Trong tổng số 68 mẫu nghiên cứu đa hình các chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y thuộc 2 dân tộc Mƣờng và Katu, chúng tôi xác định đƣợc 48 cá thể thuộc nhóm đơn bội O-M175 chiếm 70.59 %, 64 cá thể thuộc nhóm đơn bội O-P191 chiếm 94.12 % và