Kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trƣờng có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn DNA mới đƣợc tạo thành lại đƣợc sử dụng làm khuôn. Sau nhiều chu kỳ, đoạn DNA quan tâm đƣợc nhân lên gấp bội, nhờ vậy có thể có đủ số lƣợng phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo.
Mỗi một chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn sau:
- Giai đoạn biến tính: DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt độ cao (94°C – 96°C ).
- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ thích hợp, hai mồi sẽ bám vào hai đầu của đoạn DNA đích theo nguyên tắc bổ sung.
- Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng đƣợc tăng lên khoảng 70 80°C là nhiệt độ thích hợp để cho Taq DNA polymerase kéo dài chuỗi.
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên máy GeneAmp PCR 9700 của hang Applied Biosystems với tổng thể tích phản ứng là 25 µl gồm các thành phần sau: 50 ng DNA, đệm PCR 1X (đã bao gồm MgCl2) 700 mM mỗi dNTP, 5 Mm mồi và 1
33
đơn vị DreamTaq (Fermentas). Chu trình nhiệt để nhân các đoạn DNA đƣợc liệt kê dƣới đây:
- Đoạn trình tự D-loop: 96°C - 4 phút, 32 chu kỳ (94°C, 30 giây ; 58°C, 1 phút ; 72°C, 1 phút 20 giây), 72°C, 10 phút, sau đó giữ ở 4°C.
- Đoạn P186: 94°C - 4 phút, 30 chu kỳ (94°C, 30 giây ; 58°C, 45 giây ; 72°C, 45 giây), 72°C, 10 phút, sau đó giữ ở 4°C.
- Các đoạn M175, M216, P191: 94°C - 4 phút, 30 chu kỳ (94°C, 30 giây ; 56°C, 45 giây ; 72°C, 45 giây), 72°C, 10 phút, sau đó giữ ở 4°C.
- Các sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose để kiểm tra kết quả nhân các đoạn DNA. Sản phầm PCR của đoạn D-loop với kích thƣớc khoảng 1121 bp đƣợc điện di trên gel agarose 0,8 % và sản phẩm của các đoạn chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y với kích thƣớc khoảng 100bp đến 300bp đƣợc điện di trên gel agarose 2%.
- Để thu đƣợc các sản phẩm PCR đủ độ sạch để có thể tiến hành đọc trình tự, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng Kit GeneJET PCR Purification Kit của hãng Fermentas.