HPA có thành phần:
- 39,5 g Campylobacter base - 5%-10% máu ngựa
- Trimethoprim: 5 µg/ml
- Vancomycin:10 µg/ml và một số kháng sinh kháng vi khuẩn Gram dương - Nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7
Khoảng 30 – 50 µl dịch nghiền dạ dày được nhỏ trên mặt đĩa thạch và trang
đều. Đặt các đĩa Petri vào bình Jar với một bao khí BBL GasPak™ Anaerobic System
để tạo môi trường kỵ khí. Ủ Jar ở 370 C và đọc kết quả trong vòng 48 - 72 giờ. i. Định danh một số loài nấm
Tên của nấm được xác định qua giám định trình tự vùng ITSI với cặp mồi ITS1 và ITS2:
ITSI 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS2 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’
Phản ứng PCR được thực hiện trong bản 96 giếng (Applied Bioystem), mỗi giếng chứa 50 µl 1× PCR buffer (Applied Biosystems), 2.5 mM MgCl2, 250 µM dATP, 250 µM dCTP, 250 µM dGTP, 250 µM dTTP,1U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems), 200 nM mồi và 1 µl DNA (khoảng 10 ng). Phản
ứng được ủở 950C trong 10 phút, sau đó tiến hành 30-35 chu kỳ nhiệt ở 95°C 30 s, 58°C 60s và 72°C 30s. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% 0. 5xTAE và được làm sạch bằng Bộ Kit Quigen (Đức). Trình tự của
50
đoạn PCR được xác định trực tiếp không qua giải trình tự, sau đó đựợc phân tích bằng chương trình Blast trên Website.
k. Giữ giống vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật phân lập được bảo quản trong môi trường lỏng BB (28 g Brucella) chứa 30% glycerol (v/v) và bảo quản ở - 800 C.
l. Nhuộm Gram
Vi khuẩn được phết lên lam kính, sau đó được cố định nhanh trên ngọn lửa đèn cồn và được nhuộm bằng tím kết tinh (2 g tím kết tinh trong 20 ml ethanol 95%, 0.8 g ammonium oxalate trong 80 ml nước cất) trong 1 phút, rửa tiêu bản bằng nước và nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol (1 g Iod, 2 g KI trong 300 ml nước cất) trong 1 phút. Sau khi rửa lại tiêu bản bằng nước, phủ lên tiêu bản một lớp cồn 95% và rửa tiếp tiêu bản bằng nước. Nhuộm bổ sung tiêu bản bằng dung dịch safranin 0,5% trong 1 phút. Rửa tiêu bản bằng nước và xem tiêu bản dưới kính hiển vi Olympia có độ phóng đại 100 lần.
m. Nghiên cứu hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi - Kính hiển vi thường Olympia
Các mẫu vi sinh vật được nhuộm Gram theo phương pháp trên và được xem ở độ
phóng đại x100 trên kính hiển vi Olympia. Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím xanh, còn vi khuẩn Gram âm bắt màu tím đỏ.
- Kính hiển vi điện tử SEM
Các mẫu sinh phẩm chuyển đến phòng thí nghiệm kính hiển vi điện tử của Vệ
sinh Dịch tễ trung ương - Hà Nội được rửa vài lần bằng dung dịch PBS, sau đó được cố định trên lưới và nhuộm âm bản để xem dưới kính hiển vi điện tử quét SEM theo thường qui của Viện Vệ sinh Dịch tễ.
n. Xác định tên của vi khuẩn non-HP
Tên của các loài vi khuẩn được xác định bằng phương pháp giám định gen 16S rARN PCR test với cặp mồi:
F-5’CCACAGCGATGTGGTCTCAG-3’ R-5’ CTCCATAAGAGCCAAAGCCC-3’.
Phản ứng PCR được thực hiện trong bản 96 giếng (Applied Bioystem), mỗi giếng có thể tích 50 µl: 1× PCR buffer (Applied Biosystems), 2.5 mM MgCl2, 250 µM dATP, 250 µM dCTP, 250 µM dGTP, 250 µM dTTP, 1 U of AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems), 500 nM primes và 1 µl DNA (khoảng 10 ng). Phản
ứng được ủở 950C trong 10 phút để hoạt hóa DNA polymerase, sau đó 30-35 chu kỳ ở 95°C trong 30 s, 58°C 60 s và72°C 30 s.
51
Sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ sinh phẩm PCR - Kit (Quiagen-PCR Kit) và được giải trình tự trực tiếp không qua giai đọan tạo dòng bởi hãng Macrogen.(Mỹ). Các trình tự được sử lý bởi chương trình Sequenchersolfware của trường Đại học Tổng hợp Michigan.
o. Các phương pháp mô bệnh học -Chuẩn bị mẫu
Các mảnh sinh thiết dạ dày được cố định trong dung dịch formol 10%, sau đó
được chuyển đúc và vùi nến theo phương pháp thông thường. Cắt lát mảnh dạ dày có kích thước 3-5 µm và nhuộm các mảnh cắt bằng phương pháp Hematoxylin-Eosin (HE), Periodic Acid Schiff (PAS) và Giemsa. Các tổn thương dạ dày được phân tích trên tiêu bản nhuộm HE, PAS.
-Đánh giá kết quả tổn thương mô bệnh học
Các tổn thương viêm niêm mạc dạ dày được đánh giá theo tiêu chuẩn phân loại của Whitehead R. (1985)
- Xác định H. pylori trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100 lần.
Đánh giá kết quả nhiễm H. pylori : Trên tiêu bản thấy các vi khuẩn hình cong, dấu phẩy nằm rải rác trong lớp nhày, giữa các khe tế bào hoặc bề mặt tế bào biểu mô.
Đếm số lượng vi khuẩn trên 5 vi trường nhiều H. pylori nhất, chia lấy số lượng trung bình.
- H. pylori (-) (âmtính): không có H. pylori trên bất cứ vi trường nào.
- H. pylori (+) (nhẹ): có dưới 25 H. pylori trên một vi trường.
- H. pylori (++) (vừa) : có từ 25-50 H. pylori trên một vi trường.
- H. pylori (+++) (nặng) : có trên 50 H. pylori trên một vi trường.
p. Nghiên cứu Qui trình chế tạo Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm vi sinh vật dạ dày. Quá trình thiết kế và chế tạo Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm vi sinh vật được trình bầy ở sơđồ dưới đây:
Thiết kế mồi PCR và MB
cho H. pylori và C. krusei
Chuẩn bị các dung dịch gốc cho bộ sinh phẩm chẩn đoán Chuẩn bị các dung dịch
của Bộ sinh phẩm
Bộ sinh phẩm A1 Bộ sinh phẩm A2
52
-Thiết kế cặp mồi PCR và mẫu dò MB phát hiện H. pylori và C. krusei
Gen HP1125 của H. pylori và vùng ITSI của nấm C. krusei được lựa chọn để
xác định các đoạn ADN đich gắn với các mẫu dò MB.
Các nghiên cứu tin sinh học
Trình tự gen HP1125 của 66 chủng H. pylori nhận từ online database được đối chiếu để tìm ra đoạn ADN bảo thủ nhất (ADN đích) bằng chương trình ClusterX2. Cũng tương tự như vậy, trình tự vùng ITSI của 64 chủng C. krusei được đối chiếu để
xác định đoạn ADN đich.
Các mẫu dò MB
Các mẫu dò MB phát hiện vi khuẩn và nấm được đánh đấu bằng fluorophores 5- carboxyfluorescein (FAM) và chất quencher benzoic acid succinimidyl ester (dabcyl), chất đánh dấu huỳnh quang Cy3 và Back hole (hình 16).
Hình 16. Cấu tạo của các mẫu dò MB phát hiện H. pylori và C. krusei - qPCR phát hiện H. pylori và C. krusei
Chuẩn bị mẫu ADN phân tích
Mẫu sinh thiết dạ dày bảo quản ở -200 C hoặc -700 C được xác định khối lượng Cho 100 µl dịch tan của Bộ Sinh phẩm và 10 µl proteinase K nồng độ 10 mg/ml vào mỗi mẫu. Ủ các mẫu ở 550 C trong 1 giờ hoặc qua đêm. Ly tâm các ống ở 40 C trong 15 phút. Sử dụng 1µl cho mỗi phân tích.
Đoạn ADN đích trên gen HP1125 của H. pylori hoặc vùng ITSI của C. krusei
FAM cho H. pylori hoặc Cy3 cho C. krusei
Dabcyl cho H. pylori
hoặc BHQ cho C. krusei
thân
Kiểm định Đóng gói Bảo quản ở -20oC
53
Test phát hiện H. pylori
Cho vào mỗi giếng của phiến PCR 96 giếng hoặc mỗi ống PCR 1 µl DNA, sau
đó cho thêm 16 µl dung dịch A1, 2 µl mẫu dò MB của H. pylori và 1 µl DNA- Polymerase 1U/ µl. Đặt các ống vào ổ máy PCR. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy Applied Biosystems 7700 Prismspectrofluorometric thermal cycler. Hỗn hợp phản ứng PCR được ủ ở 940 C để bất hoạt DNA-Polymerase, sau đó tiến hành 35-40 chu kỳ ở 940 C 30s, ở 550 C 30s và ở 720 C 30s. Các tín hiệu huỳnh quang của đoạn DNA với mẫu dò được ghi nhận ở mỗi chu kỳ PCR ở nhiệt độ 550 C.
Test phát hiện C. krusei
Bộ sinh phẩm chẩn đoán bội nhiễm vi sinh vật dạ dày được sử dụng để phát hiện CK. Cho vào mỗi giếng của bản PCR 96 giếng hoặc mỗi ống PCR 1 µl DNA, sau
đó cho thêm 16 µl dung dịch A2, 2 µl mẫu dò MB của C.krusei và 1 µl DNA- Polymerase 1U/ µl. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy Applied Biosystems 7700 Prismspectrofluorometric thermal cycler. Hỗn hợp phản ứng PCR được ủ ở 940 C trong 5 phút để bất hoạt DNA-Polymerase, sau đó tiến hành 35-40 chu kỳở 940 C 30s,
ở 550 C 30s và ở 720 C 30s. Các tín hiệu huỳnh quang được ghi ở mỗi chu kỳ PCR ở
550 C.
- Xây dựng đường chuẩn phát hiện H. pylori và C. krusei
Hòa loãng dung dịch ADN chứa 107 / µl phiên bản của HP và CK bằng dung dịch 1 x TAE đến các nồng độ 106 /µl, 105 /µl,104 /µl ,103 /µl,102 /µl,101 /µl và 100/ µl. Dựng đồ thị tương quan giữa số phiên bản của vi sinh vật trong mẫu (trục hoành) và Ct của phản ứng PCR(trục tung), qua đó xác định độ nhậy của phản ứng PCR.
- Tính độ nhậy và độđặc thù lý thuyết của các phản ứng qPCR
Độ nhậy và đặc thù lý thuyết của phản ứng phát hiện vi sinh vật bội nhiễm
được xác định bằng công thức theo Gordon H Lemmon [40].
Sen (giá trị âm tính giả) = âm tính giả / dương tính thật + âm tính giả. Sp (giá trị dương tính giả ) = dương tính giả/âm tinh thật +dương tính giả.