b. Chủng nấm BD35 được phân lập từ một bệnh nhân viêm dạ dày mãn tính kèm nhiễm HP (A). Các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch B) Ảnh chụp vi sinh vật dưới TEM (C). Ảnh chụp vi sinh vật dưới TEM của tiêu bản lát cắt siêu mỏng (D) BDV35 là loài nấm Candida paraplosis (xác định bằng bằng giám định đoạn ITSII).
Các nguyên nhân dẫn đến nhiễm vi sinh vật của dạ dày
Dạ dày người khỏe mạnh có một hệ vi sinh vật gồm các vi khuẩn cư trú thường xuyên như H. pylori và một số vi sinh vật chịu acid như Lactobacillus và
Streptococuss. Trong quá trình sống, hệ vi sinh vật dạ dày thay đổi, đặc biệt ở những người già hoặc bị nhiễm vi sinh vật khác do những nguyên nhân chính sau đây:
(i) hệ miễn dịch suy yếu đặc biệt ở các các bệnh nhân nhiễm HIV/AIDs.
(iii) sử dụng nhiều kháng sinh hoặc sử dụng nhiều loại thuốc ức chế hệ miễn dịch. (iv) bị phẫu thuật dạ dày.
(v) bị nhiễm H. pylori lâu ngày dẫn đến giảm tiết acid của dạ dày, tạo điều kiện cho các vi sinh khuẩn khác vãng lai trong dạ dày.
350bp
40
Phát hiện nhiễm vi sinh vật dạ dày
Nhiễm vi sinh vật dạ dày liên quan chặt chẽ đến giảm acid trong dịch dạ dày người bệnh bị giảm hoặc không tiết tiết acid dạ dày. Do vậy, chẩn đoán bội nhiễm vi sinh vật dạ dày thường được xác định gián tiếp qua phân tich độ acid trong dịch dạ
dày: nếu độ acid pH >3.5 thì chắc chắn có bội nhiễm. Hình 11 giới thiệu kết quả xét nghiệm tình trạng giảm tiết acid của hệ thống Heidelberg: một viên nhộng đo pH được
đưa vào dạ dày người bệnh khi đói có pH dịch vị là 1-1.5, sau đó bệnh nhân được uống một dung dịch kiềm. Trong vòng 30 phút, nếu pH dịch dạ dày không trở về mức
độ cũ mà vẫn là 7 thì chắc chắn bệnh nhân bị thiểu năng acid dạ dày và có thểđang bị
bội nhiễm vi sinh vật ( hình 11).
Hình 11. Hệ thống phân tích Heidelberg xác định chính xác tình trạng giảm tiết HCl của dạ dày dẫn đến nhiễm vi sinh vật dạ dày.
Gần đây, Dr John McLaren-Howard đề nghị một phương pháp phát hiện tình trạng thiểu năng acid dạ dày ở người bệnh qua tìm kiếm VEGF (vascular endothelial growth factor ) do tuyến nước bọt tiết ra. Test thử dường nhưđơn giản, nhưng khá đắt khoảng $81.
Các phương pháp được trình bầy ở trên không dự đoán trực tiếp bội nhiễm dạ
dày do vi khuẩn hay nấm, vì chỉ những thông tin này mới có giá trị thiết thực đối với các bác sĩ để quyết định điều trị bệnh nhân. Mặt khác, các test thử khá phức tạp, mất nhiều thời gian và có giá thành cao.
Mẫu dò Beacon và ứng dụng trong qPCR
a. Phát minh mẫu dò Beacon
Mẫu dò Beacon phân tử (MB) được phát minh năm 1998 bởi GS. Fred Russells Kramer, Sanjanyl Tyagi và Salvatore Maras. Các nhà khoa học đã sử dụng mẫu dò MB đánh dấu huỳnh quang để gắn với một đoạn DNA đích nằm trong sản phẩm PCR và định lượng chúng bằng qPCR nhờ đo cường độ tín hiệu huỳnh quang của phức hợp
41
lai. Hiện nay, qPCR sử dụng mẫu dò Beacon MB đang được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng acid nucleic, phân biệt các allen di truyền, phân tích nhiều mẫu vật cùng một lúc, chẩn đoán trong lâm sàng [36]. Hình 12 giới thiệu một MB cổđiển được thiết kế nhiều năm trước đây.
b.Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của một mẫu dò Beacon MB
Mẫu dò MB được cấu tạo từ hai phần (i) phần lọng (loop) và (ii) phần thân (stem). Phần lọng gồm 15-25 nucleotide, phần thân gồm 5-7 nucleotide gắn với chất huỳnh quang fluorophore ởđầu 5' và với quencher ởđầu 3' [37-38].
Ở nhiệt độ thấp, MB không phát tín hiệu huỳnh quang vì chất đánh dấu huỳnh quang và quencher nằm kề nhau. Khi gắn với đoạn ADN đích, MB thay đổi cấu trúc và duỗi dài ra, do vậy nhóm fluorophore bị tách xa khỏi chất quencher và phát tín hiệu huỳnh quang (hình 13). Trong phân tích, mỗi đầu dò MB được đánh dấu với một chất huỳnh quang.
c. Ứng dụng của các mẫu dò Beacon
qPCR sử dụng các mẫu dò Beacon càng ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu y sinh và trong chẩn đoán y học vì giảm thời gian phân tích và nới rộng khả năng phát hiện các đoạn ADN đích. Một trong những thành tựu lớn nhất của công nghệ Beacon là xác định tính kháng thuốc rifampin của vi khuẩn lao trong
Hình 12. Mô hình cổ điển một mẫu dò MB của Fred Kramer và đồng nghiệp thiết kế 20 năm trước đây (1) Chất phát tín hiệu huỳnh quang Fluorophore (2) Chất làm tắt tín hiệu huỳnh quang quencher Phần lọng Phần thân 1 2 Hình 13. Mẫu dò Beacon phát tín hiệu huỳnh quang khi chuyển từ cấu trúc đóng (1) sang cấu trúc (2) khi gắn với đoạn ADN đích
1
42
vòng một vài giờ thay vì 60 ngày như trước kia (39). Năm mẫu dò MB đánh dấu các chất huỳnh quang được thiết kế để tìm năm đột biến trên gen rpoB gây kháng Rifampin của vi khuẩn lao. Trong trường hợp vi khuẩn lao không kháng rifampin, cả
năm tín hiệu huỳnh quang đều được ghi nhận. Trong trường hợp vi khuẩn lao mang
đột biến gây kháng thuốc, một (vài) tín hiệu bị biến mất (hình 14). 1 2 3
4 5 6
Hình 14. Phát hiện các đột biến trên gen rpoB gây kháng rifampin của M. tuberculosis Tất cả các đầu dò MB phát tín hiệu huỳnh quang khi gắn với các chủng nhậy cảm thuốc (chủng dại) được thử (1, 2). Một vài tín hiệu bị mất khi các mẫu dò được thử với các chủng lao kháng thuốc (3, 4,5, 6).
43
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
44
Sơđồ nghiên cứu
a.Nghiên cứu trên các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân
Nghiên cứu 1 Nghiên cứu 2 Nghiên cứu 3
500 bệnh nhân 89 bệnh nhân 76 mẫu ADN từ Mỹ
Lấy sinh thiết dạ dày bằng nội soi Giải trình tự vùng IR jhp0153-jhp0152
Nuôi cấy H. pylori Nuôi cấy H. pylori và non-HP và non-HP
-Xác định tỷ lệ nhiễm H. pylori, -Phân tích chỉ thị sinh học của HP (IR non-HP và nấm qua nuôi cấy cagA*. HspA và VacA s/m) và trình tự
-Kính hiển vi SEM/TEM của non-HP, - Định tên non-HP.
nhuộm Gram. -Xác định gen kháng Clarithromycine của - Định tên non-HP. ` vi khuẩn dạdày.
Tách ADN sinh thiết
- Xác định HPstatus của các bệnh nhân.
- Định tên nấm bằng phương pháp thông thường và qPCR.
- Nghiên cứu một số chỉ thị sinh học của H. pylori (cagA, VacA).
Ghi chú: cagA, khảo sát đầu 5’ của gen cagA
cagA*, khảo sát đầu 3’ mang motif EPIYA của gen cagA.
b.Nghiên cứu chế tạo mẫu dò MB và thử nghiệm - Thiết kế chế tạo mẫu dò.
- Thiết kế chế tạo Bộ sinh phẩm phát hiện bội nhiễm vi sinh vật dạ dày. - Thử nghiệm trên các mẫu bệnh phẩm.
- Nghiên cứu các chếđộ bảo quản.
Đối tượng nghiên cứu
45
Các bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Bưu Điện tự nguyện tham gia vào nghiên cứu và
đáp ứng các tiêu chuẩn sau được lựa chọn cho nghiên cứu: -Tuổi từ 18- 80.
- Bị viêm dạ dày mạn tính, loét hoặc ung thư dạ dày.
- Không dùng kháng sinh trong thời gian 3 tháng trước khi soi. Tiêu chuẩn loại trừ:
-Những người ngoài độ tuổi nghiên cứu.
- Những người không đồng ý tham gia nghiên cứu hoặc đã sử dụng kháng sinh trong thời gian ít hơn 3 tháng trước soi.
b.Bệnh phẩm
Các bệnh nhân được phỏng vấn về lịch sử và hiện trạng bệnh, sau đó được làm nội soi, chụp ảnh và xác định các thể bệnh viêm mạn, loét, ung thư dạ dày theo phân loại của Sydney [40]. Mẫu sinh thiết dạ dày được lấy bằng nội soi. Vị trí sinh thiết của dạ dày gồm hang vị, thân vị, rìa các ổ loét, các tổ chức thâm nhiễm nghi ung thư. Những mẫu phẩm này được phân tích ngay hoặc bảo quản và lưu giữ cho các nghiên cứu sau:
-Một mảnh ở hang vị thử urease test ngay tại phòng soi.
-Hai mảnh (một ở thân vị và một mảnh ở hang vị được cố định trong focmol 10% chuyển đến phòng thí nghiệm mô bệnh học.
Các mảnh còn lại sẽđược bảo quản trong dung dịch vận chuyển (theo Seliger H.P.J và Schroter. G ) gồm dung dịch A và B theo tỷ lệ 1:1 (dung dịch A: 8,66 g NaCl; 1,14 g KH2PO4; 1,6 g Na2HPO4 .2H2O; pha trong nước cất, pH 7,3; dung dịch B: 1,5% Glucoza) hoặc cho vào ống nghiệm vô trùng và lưu giữ trong bình N2 lỏng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Thiết bị máy móc và hóa chất nghiên cứu
a. Thiết bị máy móc
1. Máy xác định trình tự gen tự động - ABI Prism 3100 Sequencer (Applied Biosytem, Mỹ) và bộ hóa chất Thermo sequenase cycle sequencing Kit (Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy đo quang phổ (Shimadzu, Nhật Bản)
2. Máy ly tâm lạnh cỡ lớn (Sorvall, Mỹ),
3. Máy điện di ADN và máy phát hiện ADN (Mupid, Nhật Bản),
4. Máy PCR (A&B 9700, Mỹ), máy ổn nhiệt dùng nước (Memmert, Đức), 5. Máy lắc ổn nhiệt, tủ nuôi cấy tế bào (Multistron, Đức),
6. Bộ Kit tinh sạch ADN (Qiagen, Đức), 7. Gel-Doc (Pharmacia Biotech).
8. Máy nội soi dạ dày video OLYMPUS Evis EXERA 160 và các dụng cụ kèm theo: kim vô khuẩn để lấy bệnh phẩm
9. Test urease, tuýp vô khuẩn đựng bệnh phẩm nuôi cấy, tuýp đựng bệnh phẩm xét nghiệm MBH, bình đựng nitơ lỏng, bình Jar của hãng BBL (Anh).
46
10.Real-time PCR ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems).
11.ABI Prism 7000 SDS software ( Applied Biosystems).
12. NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, Minneapolis, MN, USA).
13.Tủ ấm .
14. Máy ly tâm bàn. b. Hóa chất nghiên cứu
Các hóa chất cần thiết dùng trong thí nghiệm được mua của các hãng nước ngoài (Amersham Pharmacia Biotech; Amersham Life Science; Eurogen; Promega; Sigma…) có độ tinh khiết cao.
Phương pháp nghiên cứu
a. Test thử urease
Test urease là phương pháp đơn giản để tìm H. pylori trong dạ dày các bệnh nhân: mảnh sinh thiết dạ dày được đặt vào lòng giếng của bộ Helicotest (hình 15 ), sau
đó rỏ 6 giọt dung dịch vào giếng. Sự chuyển màu của dung dịch từ vàng sang tím đỏ
chứng tỏ bệnh nhân nhiễm H. pylori.
Hình 15. Phát hiện H. pylori bằng Helicotest Giếng 1: Chứng âm Giếng 2,3,4: Kết quả dương tính Giếng 5: Kết quả âm tính Giếng 6: Chứng dương b. Nuôi cấy H. pylori
Môi trường nuôi cấy H. pylori (HPA) có thành phần (1 lit) - 39,5 g Campylobacter base - 5%-10% máu ngựa - Nystatin: 1 µg/ml - Trimethoprim: 5 µg/ml - Vancomycin: 10 µg/ml và một số kháng sinh khác - Nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7 - Máu ngựa: 5-10%
47
1.Môi trường không chọn lọc: môi trường máu và môi trường Chocolate 2.Môi trường chọn lọc: Môi trường Skirrow, môi trường Colombia
Sinh thiết dạ dày được lấy ra từ bình nitơ và được đặt vào trong đá khoảng 20 phút để cân bằng nhiệt độ, sau đó được nghiền kỹ trong 0,3ml dung dịch muối sinh lý (0,9% NaCl). Khoảng 30 – 50 µl dịch nghiền của sinh thiết trong 1xPBS được nhỏ và trang khô trên đĩa thạch. Đặt các đĩa Petri vào bình Jar với một bao khí BBL GasPak™ Anaerobic System để điều kiện kỵ khí. Đặt bình Jar vào tủ ấm ở 370C và đọc kết quả
trong vòng 48 - 72 giờ.
c. Nuôi cấy vi khuẩn non-HP và xác định tính khử Nitrate và Nitrite của vi khuẩn. Vi khuẩn non-HP được nuôi cấy trên môi trường TSA (15 g Tryptone, 5 g Soytone, 5 g Sodium Chloride, 15 g Agar) hoặc trên môi trường Non-HPA có thành phần:
- 39,5 g Campylobacter base - 5%-10% máu ngựa
- Nystatin: 1 µg/ml
- Nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7
Môi trường được khử trùng trong 30 phút ở 1210C, sau đó để hạ nhiệt độ xuống khoảng 50 - 550C và bổ xung 5% - 10% máu ngựa và các kháng sinh chống nấm. Đổ
môi trường ra đĩa Pettri. Khoảng 30 – 50 µl dịch nghiền của sinh thiết được nhỏ và trang khô trên đĩa thạch non-HPA. Đặt các đĩa Petri vào bình Jar với một bao khí BBL GasPak™ Anaerobic System at 370C để tạo môi trường kỵ khí. Đặt bình Jar vào tủấm
ở 370C và đọc kết quả trong vòng 48 - 72 giờ.
Khả năng khử nitrite và Nitrate của vi khuẩn được phát hiện bằng phương pháp Griess [37]. Nhỏ 20 µl dịch nuôi cấy vi khuẩn trên bề mặt của tấm giấy parafilm, sau
đó nhỏ tiếp 20 µl dung dịch 1% sulfanilamide trong 5% axit phosphoric ( Hình 16). Ủ
phản ứng ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-10 phút (tránh ánh sáng), nhỏ thêm 20 µl NED (0,1% N-(1-Naphthyl) ethylenediamine dihiydrochloride trong nước). Đọc kết quả sau 10 phút. Dịch nuôi cấy của vi khuẩn có màu vàng. Mẫu đối chứng gồm môi trường nuôi cấy Brucella có màu hồng đỏ.
d. Tách chiết ADN
DNA được tách chiết từ sinh thiết dạ dày và vi khuẩn bằng Bộ Kit QIA-gene (Blood and Tissue Kit) hoặc Bộ Kít Genomic DNA purification Kit(FermentasK072. DNA được được hòa trong 100-200 µl 1x TE. Nồng độ và độ tinh sạch của chế phẩm DNA được kiểm tra trên thiết bị đo quang phổ ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm hoặc trên máy NanoDrop1000, Thermo scientific.
e. Nghiên cứu một số tính trạng di truyền gây bệnh của H. pylori
48
Kiểu gen vacA s1/s2, vacA m1/m2 của các chủng H. pylori được đánh giá theo phương pháp của Guilllermo I PP. Các mồi để đánh giá kiểu gen s1/m2 theo Guillermo (personal comunication).
CagA
1.Xác định motif của gen cagA củavikhuẩn.
Đầu 3' cuả gen cagA chứa motif EPYIA được khảo sát bằng PCR test. 2 µl DNA (1-10 ng) được sử dụng để khuếch đại đầu 3’ của gen cagA bằng PCR, thể tích phản ứng 25 µl với cặp mồi: 5’-GTTAARAATRGTGTRAAYGG -3’(Y: C hoặc T; R: A hoặc G) 5’-TTTAGCTTCTGATACCGC-3' Điều kiện phản ứng Chu kỳ 25-30 vòng Hot start ở 940 C 5 phút 940C 30s 540C 30s 720 C 1 min
Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1,2%, hệ dung môi 0.5 x TAE 2. Xác định kiểu gen cagA+/cagA-
Đầu 5' của gen cagAđược khuếch đại bằng PCR test bằng với cặp mồi:
5' - CAGAF GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG-3' 5' - CAGAR CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA-3' Điều kiện PCR
5-min hot start
25 to 30 chu kỳ 94°C 30 s, 56°2 60 s, 72° C 60s.
Gen HspA ( gen mã hóa cho heat shock protein )
Gen HspAđược khuếch đại với các mồi:
5’-GCTATCTGAAAATTTGATTTCTTTTGC-3’ 5’-TGCGCTATAGTTGTGTCGC-3’
Điều kiện PCR 5-min hot start
25 to 30 chu trình, 94°C 30 s, 52°C 30 s, 72° 50s.
Vùng giữa hai gen jhp0153 và jhp0152 (IR)
Vùng IR được khuếch đại bằng các mồi:
5’–AAGAAAACCCCACGCAAG-3’ 5-’GCAAAAACTCGCTCAAAAACTC-3’ Điều kiện PCR:
5-min hot start
49
Gen 23SrRNA
Toàn bộ gen 23SrRNA 1,3 kb được khuếch đại với hai mồi: 5’-CTCCATAAGAGCCAAAGCCC-3’
5’-CCACAGCGATGTGGTCTC-3’
Điều kiện PCR: 5-min hot start
25 to 30 chu kỳ 94°C 60 s, 60°C 45 s,72°C 50s.
Gen GlmM
Phần của gen Urease Cđược khuếch đại bằng các mồi: 5’- GGATAAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGG-3’ 5’-GCTTACTTTCTAACACTAACGCGC-3’ Điều kiện PCR
5-min hot start
25 to 30 chu kỳ 94°C 60 s, 58°C 45 s,72°C 50s. h.Nuôi cấy nấm