2.2.3.1 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của CPE
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme.
Xác định nhiệt độ thích hợp (topt ) cho protease bằng cách cho protease tác động với cơ chất casein 1% pH=7 ở các nhiệt độ khác nhau: 300C; 350C; 400C; 450C; 500C; 550C; 600C; 650C; 700C trong thời gian 30 phút, sau đó nhanh chóng làm lạnh, tiến hành xác định hoạt tính protease, chọn ra nhiệt độ tối thích cho CPE.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Sơ đồ 2.8 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ của protease CPE.
2.2.3.2 Xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của protease CPE
pH cũng là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh lớn đến hoạt tính enzyme, mỗi enzyme có một khoảng pH hoạt động thích hợp và một giá trị tối ưu nhất.
Tiến hành ủ enzyme protease của CPE với dung dịch casein 1% có môi trường pH thay đổi từ 3 đến 9 trong thời gian 30 phút, sau đó xác định hoạt độ enzyme.
CPE
Cho tác dụng với casein ở các nhiệt độ (0C)
Xác định hoạt độ của enzyme
Chọn topt cho enzyme
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Sơ đồ 2.9 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH tới hoạt độ của protease CPE.
2.2.3.3 Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt độ protease của CPE CPE
Tiến hành xác định khả năng chịu muối của protease ở các nồng độ từ 0% đến 12%, xác định hoạt tính protease của CPE và đưa ra kết luận.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Sơ đồ 2.10 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ muối ăn tới hoạt độ của protease CPE.
CPE
Cho tác dụng với casein ở các nồng độ muối ăn (%)
Xác định hoạt độ của enzyme
Chọn nồng độ muối ăn thích hợp
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
DC; CPE
Cho tác dụng với casein ở các pH
Xác định hoạt độ của enzyme
Chọn pHopt cho enzyme
2.2.3.4 Xác định độ bền nhiệt của protease CPE
Xử lý nhiệt protease bằng cách giữ enzyme ở nhiệt độ 600C trong các khoảng thời gian khác nhau: 0; 10; 20; …; 70 phút. Sau đó nhanh chóng làm lạnh enzyme về nhiệt độ thường và xác định hoạt độ của protease.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Sơ đồ 2.11. Bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của protease CPE. 2.2.4 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng bằng chế phẩm protease nội tạng
2.2.4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến quá trình thủy phân
Thủy phân nguyên liệu đầu tôm bằng CPE bổ sung với các nồng độ khác nhau từ 1% đến 4% so với nguyên liệu. Quá trình thủy phân được tiến hành ở nhiệt độ phòng, pH tự nhiên của nguyên liệu với tỷ lệ nước bổ sung là 1:1 (v/w), mỗi mẫu thủy phân 100g, sau các thời điểm 0; 2; 4; 6; 8 giờ lấy mẫu gia nhiệt ở 900C trong 10 phút để bất hoạt enzyme, lọc thu dịch và đem dịch đi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy dịch lọc đem đi xác định hàm lượng protein hòa tan, từ đó lựa chọn nồng độ CPE bổ sung thích hợp.
Vì nguyên liệu đầu tôm chứa nhiều vi sinh vật gây ươn thối, hư hỏng nên nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng sau khi được loại bỏ tạp chất, xay nhỏ thì được gia nhiệt ở nhiệt độ 900C trong 10 phút để tiêu diệt vi sinh vật gây hư hỏng cho tôm và bất hoạt enzyme nội tại, sau đó đưa về nhiệt độ phòng và bổ sung CPE để thủy phân.
CPE
Giữ ở nhiệt độ 600C trong các thời gian (phút)
Xác định hoạt độ của enzyme
Kết luận về sự bền nhiệt của enzyme
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Sơ đồ 2.12.Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân.
2.2.4.2 Bố trí thí nghiệm xác định chế độ thủy phân tối ưu
Mục đích: Phương pháp quy hoạch thực nghiệm được sử dụng là phương pháp hàm đáp ứng bề mặt-thiết kế có cấu trúc tâm (RSM-CCD), đây cũng là tính mới của đề tài, nhằm mục đích thu được dịch thủy phân có hàm lượng protein hòa tan cao.
Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một phương pháp thống kê sử dụng các dữ liệu định lượng từ các thí nghiệm để xác định và giải thích nhiều biến phương trình. RSM khám phá các mối quan hệ giữa các biến giải thích và một hay nhiều biến phản ứng. Phương pháp này đã được giới thiệu bởi GEP Box và KB Wilson vào năm 1951.
Ý tưởng chính của RSM là sử dụng một chuỗi các thí nghiệm được thiết kế để có được một phản ứng tối ưu. Để làm điều này, Box và Wilson đã sử dụng một mô hình đa thức bậc hai. Mô hình này chỉ là tương đối nhưng lại dễ dàng áp dụng.
Trong trường hợp chung, người ta gọi là bề mặt đáp ứng, đại diện hình học hàm mục tiêu của một quá trình vật lý không gian – thời gian ngẫu nhiên cho những biến kích thích. Đặc tính được nghiên cứu, hay hàm mục tiêu Y là kết quả của sự chuyển
Nguyên liệu
Xử lý
Bổ sung enzyme với các tỷ lệ (%)
1
Thủy phân
Kiểm tra hàm lượng protein hòa tan
Chọn tỷ lệ enzyme thích hợp
đổi bằng một chức năng đáp ứng rõ ràng (hay còn gọi là chức năng chuyển đổi). Sự thay đổi giá trị của các biến đầu vào sẽ kéo theo sự thay đổi chức năng của hàm mục tiêu. Những mô hình thí nghiệm của mặt đáp ứng lưu ý đến sự lựa chọn các biến kích thích, xác định các giai đoạn quan sát và tính toán sai số. Những biến đầu vào Xi (i = 1, …,n) cũng được gọi là những biến cơ sở. Chúng được đặc trưng bởi một loạt các thông tin thống kê µj (j = 1,…,p) (chức năng phân phối độc lập hoặc tương quan, cơ hội chuẩn hóa…). Trong trường hợp chung, những biến Xi là những biến thay đổi theo không gian – thời gian.
Nói chung, hình thức rõ ràng của chức năng chuyển đổi này tùy thuộc vào các biến cơ sở là không được biết đến, và việc nghiên cứu về tính xấp xỉ được gọi là chức năng đáp ứng trở nên cần thiết. Thông thường hơn, nó xuất hiện trong một họ chức năng thường là tuyến tính hoặc phi tuyến tính và được đặc trưng hóa bởi những thông số Xk
(k=1,…,l) một cách ngẫu nhiên hay xác định. Việc điều chỉnh mục tiêu phải dựa trên một cơ sở của những số liệu thí nghiệm (thí nghiệm vật lý hay số học) và một hệ mét cho việc tính toán các sai số, nó cho phép ta suy ra được các thông số Xk. Sự biểu diễn hình học của chức năng đáp ứng dưới dạng một đường cong, một mặt phẳng hoặc một mặt phẳng gia tăng được gọi là bề mặt đáp ứng.
Phương án có cấu trúc tâm (CCD) là một trường hợp đặc biệt trong các nhóm mô hình quy hoạch thực nghiệm. Nó được cấu thành từ ba thành phần:
-Nhân: là một phương án tuyến tính với 2k đỉnh của một hình khối đều trong không gian k chiều. Nếu k>5, có thể giảm bớt số thí nghiệm bằng cách sử dụng phương án yếu tố từng phần 2k-1.
-2k điểm sao (*) nằm trên các trục tọa độ của không gian yếu tố. Các tọa độ điểm sao là (±α, 0,0,…,0), (0,±α,0,0…), (0,0,…,0,±α). α là khoảng cách từ tâm phương án đến điểm sao gọi là cánh tay đòn sao. Các điểm sao là cần thiết để mở rộng không gian nghiên cứu khảo sát tác động của một yếu tố đơn để có thể tìm được các ước lượng của hệ số bij và bii trong phương trình hồi quy bậc 2.
-n0 thí nghiệm ở tâm phương án để tìm phương sai tái hiện.
Cánh tay đòn sao α và bố trí thí nghiệm n0 ở tâm được chọn phụ thuộc vào tiêu chuẩn tối ưu, thường là phương án trực giao hay phương án quay.
Phương trình hồi quy (mô hình hóa) được biểu diễn bằng phương trình sau: Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b12X1X2+b23X2X3+b13X1X3+b11X12+b22X22+b33X32
Trong đó: b0: là hệ số tự do b1, b2, b3: là hệ số bậc 1 b11, b22, b33: là hệ số bậc 2 b12, b23, b13: hệ số của từng cặp yếu tố. X1,X2,X3 : là các biến Y : là hàm mục tiêu
Để xác định bài toán tối ưu hóa thực nghiệm, cần phân tích các thông số đầu vào, các thông số đầu ra. Cần nghiên cứu các thông số quá trình thủy phân và hàm mục tiêu.
Nguyên liệu đầu tôm, được bổ sung tỷ lệ nước/nguyên liệu = 1/1. Gia nhiệt ở 900C trong 10 phút. Sau đó được thủy phân theo mô hình qui hoạch thực nghiệm Composit.
+ Các yếu tố cố định: Tỷ lệ nước/ nguyên liệu= 1/1, pH tự nhiên. + Các yếu tố cần tối ưu:
- Nồng độ CPE (X1): trong khoảng [2-5%]
- Nhiệt độ thủy phân (X2): trong khoảng [50-700C] - Thời gian thủy phân (X3): trong khoảng [2-6 giờ]
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến thực của công đoạn thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng CPE
STT
Biến mã hoá Biến độc lập Hàm mục tiêu
X1 X2 X3 Nồng độ CPE (%) (X1) Nhiệt độ (0C) (X2) Thời gian (giờ) (X3) Hàm lượng Pr (mg/ml) (Y) 1 -1 -1 -1 2 50 2 2 1 -1 -1 5 50 2 3 -1 1 -1 2 70 2 4 1 1 -1 5 70 2 5 -1 -1 1 2 50 6 6 1 -1 1 5 50 6 7 -1 1 1 2 70 6 8 1 1 1 5 70 6 9 -1,682 0 0 0.98 60 4 10 1,682 0 0 6.02 60 4 11 0 -1,682 0 3.5 43.18 4 12 0 1,682 0 3.5 76.81 4 13 0 0 -1,682 3.5 60 0.64 14 0 0 1,682 3.5 60 7.36 15 0 0 0 3.5 60 4 16 0 0 0 3.5 60 4 17 0 0 0 3.5 60 4 18 0 0 0 3.5 60 4 19 0 0 0 3.5 60 4 20 0 0 0 3.5 60 4
2.2.5 Xác định tỷ lệ phối trộn bột đạm với các nguyên liệu phụ để thử nghiệm sản xuất bột canh tôm sản xuất bột canh tôm
Tỷ lệ phối trộn bột đạm với các nguyên liệu phụ để sản xuất thử nghiệm 100g bột canh tôm được bố trí theo bảng sau:
Bảng 2.2 Thành phần phối trộn nguyên liệu trong 100g bột canh tôm
Thành phần Hàm lượng (g) Hỗn hợp 1 Hỗn hợp 2 Hỗn hợp 3 Hỗn hợp 4 Bột đạm 40 x x 45 x x Muối iod 35 x x 40 x x Đường 8 x x 10 x x Bột ngọt 6 x x 8 x x Tiêu 2 x x x x Hành 2 x x x x Iod 40mg/kg muối x x x x
Nguyên liệu được phối trộn với các theo các tỷ như bảng 2.2 sau đó đánh giá chất lượng cảm quan để chọn ra công thức phối trộn thích hợp.
2.3 Phương pháp phân tích đã áp dụng
- Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Biuret theo Gornall AG, Bardawill CT, David MM (1949).
- Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Anson cải biến.
2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 mẫu song song. Kết quả thí nghiệm được xử lý thống kê để loại bỏ giá trị bất thường và đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa của giá trị trung bình trên phần mềm Excel 2007. Đồ thị được xây dựng trên phần mềm Excel 2007.
Phần nghiên cứu tối ưu hóa sử dụng phân tích hồi quy đa biến. Các phân tích hồi qui tuyến tính, mô hình hồi qui và bề mặt đáp ứng của quá trình thủy phân được xây dựng với sự hỗ trợ của phần mềm Design Expert 8.0.7.1(DX8).
Chương 3:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu thu nhận protease và một số yếu tố ảnh hưởng đến protease thu nhận từ đầu tôm thẻ chân trắng thu nhận từ đầu tôm thẻ chân trắng
3.1.1. Xác định dung môi chiết thích hợp:
Tiến hành thí nghiệm như sơ đồ 2.2, kết quả thu được như sau, thể hiện ở hình 3.1, và bảng 1 phụ lục B.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt độ của DC.
Kết quả cho thấy protease trong DC thu được khi chiết bằng đệm Phosphate, pH =7 có hoạt độ cao gấp 1.126 lần hoạt độ của protease trong DC khi chiết bằng nước cất và gấp 1.243 lần hoạt độ của protease trong DC khi chiết bằng nước muối 1%.
Hoạt độ riêng của protease trong DC thu được khi chiết bằng đệm phosphate cũng cao hơn khi chiết bằng nước muối hay nước cất.
Kết quả này có thể được giải thích là môi trường đệm phosphate chứa nhiều ion
Như vậy, khi chiết bằng các dung môi khác nhau thì hoạt độ của protease trong DC thu được từ đầu tôm thẻ chân trắng là khác nhau. Dung môi thích hợp cho việc chiết rút protease từ đầu tôm thẻ chân trắng là đệm phosphate.
0 20 40 60 80 100 120
nước cất nước muối đệm phosphate
H o ạt đ ộ tư ơ n g đ ố i (% s o v ớ i c ự c đ ại )
3.1.2. Xác định tỷ lệ dung môi chiết thích hợp
Tiến hành thí nghiệm như sơ đồ 2.3, kết quả thu được như sau, thể hiện ở hình 3.2, và bảng 2 phụ lục B.
Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến hoạt độ của protease DC.
Kết quả cho thấy với mỗi tỷ lệ dung môi chiết khác nhau thì hoạt tính của protease DC là khác nhau.
Hoạt độ của protease DC tăng dần khi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tăng, và ở tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 3:1 thì protease DC thu được có hoạt độ cao nhất. Khi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu vượt quá tỷ lệ 3:1 thì hoạt độ của protease DC lại giảm dần xuống.
Điều này có thể là do ở tỷ lệ dung môi chiết/nguyên liệu thấp thì protease có trong nguyên liệu chưa khuếch tán hết ra ngoài môi trường nên khi tăng tỷ lệ dung môi chiết lên thì các protease này khuếch tán ra nhiều hơn, làm cho hoạt độ của protease DC tăng lên và đạt cực đại khi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 3:1.
Sau đó, khi tăng tỷ lệ dung môi chiết lên thì hoạt độ của protease DC lại giảm đi vì sau khi nồng độ protease DC đạt cực đại mà lại tăng thể tích dung môi lên làm nồng độ protease DC giảm đi, đồng thời các protein hòa tan khác lại khuếch tán vào môi trường nhiều hơn, dẫn đến hoạt độ của protease DC giảm xuống.
0 20 40 60 80 100 120 1.0/1 1.5/1 2.0/1 2.5/1 3.0/1 3.5/1 4.0/1 4.5/1 5.0/1 H o ạt đ ộ tư ơ n g đ ố i (% s o v ớ i c ự c đ ại )
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
Trên cơ sở các phân tích số liệu trên rút ra được kết luận là: Tỷ lệ dung môi chiết/nguyên liệu thích hợp nhất cho quá trình chiết rút protease từ đầu tôm thẻ chân trắng là 3:1. Trước giá trị này thì hoạt độ của protease DC tỷ lệ thuận với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu. Sau giá trị thích hợp này thì hoạt độ của protease DC tỷ lệ nghịch với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu. Nếu tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) quá lớn hay quá nhỏ thì hoạt độ của protease DC thu được thấp.
Như vậy, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp để chiết protease là 3:1
3.1.3. Xác định thời gian chiết thích hợp:
Tiến hành thí nghiệm như sơ đồ 2.4, kết quả thu được như sau, thể hiện ở hình 3.3, và bảng 3 phụ lục B.
Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt độ của protease DC.
Kết quả cho thấy trong giai đoạn đầu tiên thì thì hoạt độ tương đối của protease DC tăng tỷ lệ thuận với thời gian chiết rút, và hoạt độ tương đối của protease DC đạt cực đại khi chiết rút trong thời gian 50 phút.
Nếu thời gian chiết rút dài hơn 50 phút thì hoạt độ tương đối của protease DC lại tỷ lệ nghịch với thời gian chiết rút enzyme.
Điều này có thể được giải thích là khi thời gian chiết rút ngắn, nhỏ hơn 50 phút thì lượng protease trong đầu tôm chưa được hòa tan hoàn toàn trong dung môi chiết, vì thế khi thời gian chiết tăng lên thì kết quả là ta thu được nhiều protease hơn, hoạt độ