N hằm một bước nữa nđng cao độ tinh sạch của chế phẩm pfu ADN pol. chúng tôi đê tiến hănh loại im idazol ra khỏi ch ế phẩm Pfu ADN pol thu được từ bước sắc ký âi lực qua cột N i-A garose ở trín, sử dụng centricon loại 30 kDa cât bỏ (30 kD a cut off) vă sắc ký ch ế phẩm enzym qua cột H eparin-Sepharose 4B. Phđn protein gắn trẽn cột được đẩv ra bêng dung dịch KCl ờ nónọ độ 500 mM pha trona
đệm A. Q ua bước sêc ký năy, Pfu ADN pol có m ặt ở phần dịch đẩy vă cũn ° chi có m ột băng protein trín SDS-PAGE vói kích thước 92 kD a (hình 14, cột 4) vă có hoạt tinh tong hợp A D N trong thi nghiệm nghiệm PCR (hình 15, côt 6) cũ n° như tron ° thí nghiệm kĩo dăi oligo trong phức hợp T-P (hình 16, cột 8). Như vậy chế phấm
Pfu ADN pol m ă chúng tôi thu được lă đê tinh sạch. K ết quả định lượn° protein cho thấy chúng tôi đê thu được khoảng 25 mg Pfu A D N pol tinh khiết từ 1 lit dịch nuôi cấy tế băo ban đầu, chiếm khoảng 15% protein dịch chiết tế băo sau khi xử lý nhiệt.
ivgnien cưu san xuai enzym r ju ADN polymerase bằng công ngliệ ADN tâi tổ hơp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Ma so: QGTĐ.03.03
Hình 16. Điện di sản phẩm kiểm tra hoạt tính của Pfu ADN pol trín gel polyacrylamid
C ột 1: Mối {30 nucleotid) C ột 2: Khuôn (62 nucleotid)
Cột 3: Hồn hợp phản ứng không có P fu ADN pol
CỘI 4: Hỗn hợp phăn ứng + P fu ADN pol của stra ta ge n e
C ột 5: Hỗn hợp phản úng + dịch chiết
C ột 6: Hỗn hợp phản ứng + dịch không hấp phu
c ỏ t 7: Hỗn hợp phản ứng + dịch đẩy bởi 250 mM imidazol
C ôt 8: Hỗn hợp phăn ứng + Pfu ADN pol qua cột H eparin-Sepharose
N hư vậy, bằng việc thiết k ế gen pfu văo vector pET28a vă biến nạp văo tế băo
E. coỉi chủng BL21(D E3) m ang plasm id pLysS đê cho phĩp chúng tỏi biểu hiện thănh công Pfu DNA pol. C húns tôi cũng đê tinh sạch được Pfu DNA pol từ dịch chiết tế băo nuôi cấy băng m ột qui trình 3 bước: xử lý nhiệt dịch chiết ờ 75"C irons 15 phút, sắc ký qua cột N i-Agarose vă sắc ký qua cột H eparin-Sepharose. Chế phẩm enzym thu được chỉ có một bănơ protein duv nhất, có kích thước khoang 92 kDa
ivgnien cưu san xuat eniym t'Ju ADN polymerase bằng cóng nghệ ADN tâi tổ họp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03_________________________
trín SDS-PAGE vă có hoạt tính tổng hợp A D N trong PCR cũng như trona thí nghiệm kĩo dăi oligo.
Sử dụng qui trình tinh sạch thiết lập được, chúng tôi đê tiến hănh sản xuất một lượng tương đối lớn ch ế phẩm Pfu A DN pol cho câc thử nghiệm nhđn băn PCR, nghiín cứu tính chất cũng như gửi ch ế phẩm cho câc đơn vị bín ngoăi d ùn s thử. Từ một lit dịch tế băo lín m en chúng tôi thu được khoảng 25-26 m2 enzvm tinh khiết với tổng hoạt độ lă khoảng 40.000 đơn vị.
Đ ể biểu hiện gen pfu, D abrowski vă K ur (1998) đê sử dụng vector pET30LIC. m ột vector tương tự như hệ thống vector pET28a mă chúng tôi đê sử dụng. Câc tâc giả năy đê dùng m ột bước sắc ký qua cột N i-TED-Sepharose để tinh sạch enzym tâi tổ hợp vă đạt đến độ sạch 97% . Tuy nhiín, theo chúng tôi, câc chế phẩm enzym dùng trong nhđn dòng gen nếu chỉ qua một bước sắc ký âi ỉực có thể vẫn còn lẫn một số protein không m ong muốn ở mức độ thấp, khó có khả năng phât hiện bằng điện di.
Trong nghiín cứu của chúng tôi, nhờ việc thiết k ế hai điểm cắt N ileỉ vă Sal\
văo cặp mồi nhđn gen, nín gen pfu có thể được dễ dăng lắp ghĩp đặc hiệu văo vector pET28a vă kết hợp được trình tự 6xHis, tạo điều kiện cho việc tinh sạch enzym qua cột sắc ký âi lực N i-A garose. Việc phât hiện ra khả năng bâm của Pfu ADN pol văo gel H eparin-Sepharose vă bổ sung thím bước sắc ký âi lực qua cột năy đê cho phĩp chúng tôi m ột lần nữa loại trừ khả năng lẫn câc protein không m ong muốn trong chế phẩm Pfu A D N pol. Qui trình tinh sạch được thiết lập khâ đơn giản, cho phĩp thu được tới 25-26 mg Pfu A D N pol tinh khiết từ 1 lit dịch tế băo E. còi nuôi cđy, tương tự như hiệu suất m ă D abrowski vă K ur (1998) thu được khi dùng với hệ thông vector pET30LIC.
3.4. NGHIÍN CỨU MỘT số TÍNH CHẤT CỦA PFU ADN POL YMERASE TÂI Tổ HỌP
Sau khi thu nhận được chế phẩm Pfu ADN pol tinh sạch chúng tòi đê sử dụng ch ế phẩm enzym để nghiín cứu m ột số tính chất khâc nhau.
3.4.1. Ảnh hường của một số hợp chất khâc nhau lín hoạt độ tổng hợp ADN của fifty ADN polymerase
Trong phần thí nghiệm năy, hoạt độ tổng hợp A DN của chế phâm Pfu ADN pol được đânh giâ thông qua khâ nđng kĩo dăi oligo trong phức hơp khuôn-m ỏi (T- P) khỉ có dNTPs. Đ ể tìm hiểu ảnh hường của câc chất khâc nhau lín hoạt độ Pfu
IV gnien cuu san xuai enzym rju ADN polymerase bang công nghệ ADN tâi tổ họp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03
A D N pol, chất cần khảo sât được ủ trước với enzym trong môi trường đệm phản ứng, có m ặt cả T-P, sau đó mới bổ sung dNTPs để bắt đầu phản ứng. Kết quả n2hiín cứu ảnh hưởng của N aN 3, N aF, m onocaprin, heptyl paraben, EDTA vă Z n S 0 4 lín hoạt độ của Pfu ADN pol được trình băy ở hình 17 vă cho thấy N aN 3 ờ câc nồng độ 0,1-3 m M không ức chế hoạt động của Pfu A D N pol (hình 17A). T ừ lđu N aN 3 vẫn thường được dùng lăm chất khâng khuẩn, nồng độ hiệu quả lă 0,02% (\v/v), tươns ứng với khoảng 3 mM. K ết quả năy cho phĩp bổ sung N aN 3 ở n ồ n2 độ 0.02% (khoảng 3 m M ) văo ch ế phẩm Pfu ADN pol để chống nhiễm khuẩn khi cần thiết mă không ảnh hưởng đến hoạt động của enzym.
Tương tự như phât hiện gần đđy của chúng tôi về ảnh hưởng của câc chất khâc nhau lín hoạt động của Taq ADN polym erase thì N aF ở nồng độ 1-50 m M (hình 17B), m onocaprin ở nồng độ từ 2-50 m M (hình 17C), heptyl paraben ở n ồn2 độ 10- 80 m M (hình 17D) đều không ảnh hưởng đến khả năng tổna hợp ADN của Pfu
A D N pol. Ngược lại, EDTA ở nồng độ 2 m M trờ lỉn đê ức chế hoạt độna của Pfu
A D N pol (hình 17 E). Tâc dụng ức chế năy liín quan đến hoạt tính tạo phức của ED TA với ion M g2+ vốn rất cần cho hoạt động tổng hợp ADN của Pfu ADN pol cũng như T a q ADN pol hay nhiều ADN polym erase khâc (A bram son, 1995).
K ẽm sunphat (Z n S 0 4) tỏ ra lă chất ức chế mạnh hoạt động của Pfil ADN pol, thậm chí ở nồng độ 0,5 mM (hình 16F). K ết hợp với phât hiện về sự ức chế của Z n S 0 4 đối với Taq ADN polym erase (Phan et a l., 2005) cũng như nhiều enzym khâc (Phan et al„ 2004) chúng tôi cho rằng kẽm có thể lă chất ức ch ế chung của câc ADN polym erase hoặc ít nhất cũng lă của một sỏ' nhóm ADN polym erase.
Hình 17A. Ảnh hưởng của azid n atri lỉn hoạt độ sinh tổng hựp ADN của Pfu ADN polym erase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C ột 1: Mối (P) 32 nt. Cột 2: Khuôn (T) 60 nt. Cột 3: Phức hơp T-P Cột 4: Phức hợp T-P với p đê được kĩo dăi bằng T nhờ P fu ADN pol
Cột 5-8: Tương úng với nống độ N aN 3 từ 0,1 mM, 0,5 mM, 1,0 mM vă 3 mM
ngrtien cưu san xuùt enzym Ffu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGĨĐ.03.03
Hình 17B. Ảnh hưởng của NaF lẻn hoạt độ sinh tổng hợp ADN của Pfu ADN polymerase
C ột 1: Mồi (P) 32 nt. Cột 2: Khuôn (T) 60 nt. C ột 3: Phức hợp T-P. C ột 4: Phức hợp T-P với p đê được kĩo dăi bằng T nhờ Pfu ADN pol
C ột 5-10 : Tương ứng với nồng độ NaF từ 1,25 mM, 2,5 mM, 5 mM, 12,5 mM, 25 mM vă 50 mM
Hình 17C. Ảnh hưởng của m onocaprin lẽn hoạt độ sinh tổng hợp ADN của Pfu ADN polymerase
Cột 1: Mối (P) 32 nt. c ỏ t 2: Khuôn (T) 60 nt. Cột 3: Phức hợp T-P. Cột 4: Phức hợp T -P với p đê đươc kĩo dăí bằng T nhờ Pfu ADN pol
C ột 5-10 : Tương ứng với nống độ m onocaprin từ 0 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20m M vă 50 mM (trong 10% ethanol)
Hình 17D. Ảnh hưởng của heptyl paraben lẻn hoạt độ sinh tổng hợp ADN của Pfu ADN polymerase
Cột 1: Mối (P) 32 nt. Cột 2: Khuôn (T) 60 nt. C ột 3: Phức hop T-P. Cột 4: Phức hợp T -P với p đê được kĩo dăi bằng T nhờ Pfu ADN poỉ
C ột 5-9: Tương ứng vối nồng độ heptyl paraben từ ũ mM, 10 mM, 20 mM, 40 mM va 80 m M (trong 10% ethanol)
lygmen cưu săn xuât enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê so: QGĨĐ.03.03
9 10
Hình 17E. Ảnh hưởng của EDTA lĩn hoạt độ sinh tổng hợp ADN của Pfu ADN polymerase
Cột 1: Mổi (P) 32 nt Cột 2: Khuôn (T) 60 nt. Cót 3: Phức hơp T-P. Cột 4: Phức hợp T-P với p đê được kĩo dăi bằng T nhờ Pfu ADN pol c ỏ t 5-10: Tương ứng với nống độ ED TA lừ 0,5 mM, 1 mM, 2 inM, 3 mM, 4 mM vă 5 mM
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 17F. Ảnh hưởng của Z n S 0 4lín hoạt độ sinh tổng hựp ADN của Pfu ADN polymerase
Cột 1: Mồi (P) 32 nt. Cột 2: Khuôn (T) 60 nt. C ột 3: Phức hợp T-P. C ột 4: Phức hợp T-P với p đê đươc kĩo dăi bằng T nhờ Pfu ADN pol C ột 5-10 : Tương ứng với nồng độ Z n S 0 4 từ 0,05 mM, 0,1 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM vă 2 mM
3.4.2. Độ bến của chế phdm PfuADN polymerase
M ặc dầu độ bền nhiệt của Pfil A DN pol tự nhiín đê được nghiín cứu (A bram son, 1995), nhưng ch ế phẩm Pfii ADN pol do chúng tôi tạo ra lă thuộc loại protein tâi tổ hợp, có gắn thím một phần trình tự 20 axit am in ở đẩu N để giúp dơn giản quâ trình tinh sạch nín chúng tôi đê tiến hănh kiím tra độ bền qua khâ năns nhđn bản A DN trong PCR của ch ế phẩm ở hai ch ế độ nhiệt khâc nhau: x ử l ý ơ
100"C trong câc khoảng thời gian từ 10 - 60 phút vă giữ enzym ở nhiệt độ phòng với sự có m ặt của chất khâng khuẩn N aN , ở nồng độ 0,02% .
Dựa trín số đơn vị hoạt động thường dùng cho PCR (2,5 đơn vị cho m ột phản ứng có tổng thể tích 25 p.1) vă bằng việc sử dụng ch ế phẩm có hoạt độ cao (2,5. 5 vă 10 đơn vị/|4,l, tương ứng với mức pha loêng 4, 2 vă 1 lần), chúng tôi thấy khả năng nhđn bản A D N của chế phẩm Pfu A D N pol tâi tổ hợp sau câc thời gian xử lý từ 10
đến 60 phút ở 100°c lă hoăn toăn tương ứng như mẫu kiểm tra được giữ ở 4 °c VỚI
cùng thời gian (hình 18A). Điều năy chứng tỏ enzym Pfit ADN pol tâi tổ hợp rất bền với nhiệt, không hề bị m ất hoạt động sau khi xử lý. Kết quả năy lă cơ sở đảm bảo cho việc sừ dụng enzym năy trong PCR với câc điều kiện biến tính ADN ở nhiệt độ cao hơn thông thường cũng như với thời gian kĩo dăi.
Tương tự, việc giữ enzym ở nhiệt độ phòng (25-30°C) trong vòns 4 ngăy sau đó thử hoạt độ qua khả năng nhđn bản ADN bằng PCR cho thấy Pfu ADN pol tâi tổ hợp vẫn duy trì hoạt tính nhđn bản tốt như giữ ở -2 0 °c (hình 18B). C húns tôi cũns đê giữ đệm Pfu ADN pol lOx ở nhiệt độ phòng trong cùng thời gian vă thấy răns việc giữ đệm như vậy không lăm m ất hoạt độ của Pfu ADN pol. Câc số liệu năy gợi ý khả năng sử dụng N aN 3 để bảo quản chế phẩm Pfu ADN pol trong nhữns điều kiện thiếu phương tiện giữ lạnh.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ivgnien cuu san xuai enzym f f u ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp
Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGĨĐ.03.03_________________________________
Hình 18. Điện di sản phẩm PCR sử dụng Pfu ADN pol sau khi xử ủ 100 ’C (A) vă giữ ờ nhiệt độ phòng (B) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A) c ỏ t 1: Thang chuẩn ADN 250 bp. Cột 2-4: Pfu giữ ờ 4°c, pha loêng tương ứng 1. 2 va 4 lần. C ột 5-7 Pfu giữ ở 100°c, 10 phút, pha loêng tương ứng 1, 2 vă 4 lđn. C õt 3-10: p fu
g iử ở 100°c, 40 phút, pha loêng tương úng 1, 2 vă 4 lấn. Cột 11-13: Pfu giữ ở 10CPC, 60
phút, pha loêng tương ứng 1, 2 vă 4 lần
B) C ột 1: Thang chuẩn ADN 250 bp. C ột 2-4: P fu giữ ở 4 ° c , pha loêng tương ứng 1, 2 va 4 lần. C ột 5-7: P fu giữ ở nhiệt đỏ phòng, 4 ngăy, pha loêng tương ứng 1, 2 va 4 lấn
ivgnien cuu san xuai enzym r ju ADN polymerase bảng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Ma so: QGTĐ.03.03
3.4.3. Một SỐ tính chất khâc của pfu ADN polymerase
N goăi hoạt tính tổng hợp ADN, Pfu A D N pol còn có hoạt tính 3 ’-5 ’ exonuclease (A bram son, 1995), nhờ hoạt tính năy m ă enzym có thể loại bỏ câc nucleotid bị đưa nhầm văo khi tổng hợp, do đó sản phẩm tổng hợp ít sai sót. Đđy cũng lă điểm khâc biệt giữa Pfu ADN pol vă Taq ADN pol được biết lă khònt: có hoạt tính sửa lỗi. Tuy vậy, T aq ADN pol lại có hoạt tính term inal transferase cho phĩp gắn thím gốc adenosin m onophosphat (A) văo đầu 3 ’ của đoạn ADN sợi kĩp (Clark, 1988). Chính vì đặc điểm năy mă câc sản phẩm nhđn bản PCR dùna Taq
ADN pol có thể được đưa văo vector hở có gốc T ở hai đầu 3 ’, dựa trín sự ghĩp cặp đặc hiệu gữa A vă T. Trong khi đó sản phẩm nhđn bản bằng PCR dùna Pfu ADN pol lại có đầu bằng. Chúng tôi đê sử dụng kit nhđn dòng với vector hờ, đầu b ă n ơ cùa hêng Invitrogen để nhđn dòng câc đoạn gen được nhđn lín bằng chế phẩm Pfii ADN pol thu được. Sau khi ghĩp nối đoạn gen văo vector, biến nạp văo E. coli, chúng tỏi đê thu nhận được hầu hết câc khuẩn lạc trắng trín môi trường có kanam vcin 50 |ig/m l, X-gal lăm cơ chất vă IPTG lăm chất cảm ứng. Khi sử d ụ n2 ADN tâch chiết từ 8 khuẩn lạc trắng (chọn ngẫu nhiín) để kiểm tra sự có mật của đoạn ơen trong vector bằng PCR với chính cặp mồi pET28F, pET28R như đê d ùns ban đẩu, kết quă điện di sản phẩm PCR (hình 19) cho thấy cả 8 mẫu ADN từ khuân lục trân ” đều chu băng nhđn bản 0,6 kb, đúng như băng năy trước đó. Điều năy cho phĩp khảng dinh việc nhăn dòng của đoạn gen nhđn bản bằng Pfu ADN pol đê thănh công va chứng tỏ câc đoạn gen nhđn bản có dạng đầu tù.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 kb ►
Hình 19. Điẻn di sản phẩm PCR nhđn đoạn 0,6 kb được nhăn dòng văo vector pCR 2.1 băng Pfu ADN polymerase
C ột 1: Thang chuẩn ADN 250 bp
C ôt 2-9: ADN khuôn lă plasm id tâch từ câc khuẩn lac trâng C ột 10: ADN khuôn lă plasmid tâch từ khuẩn lac xanh
K hả năng nhđn bản câc đoạn ADN có kích thước khâc nhau lă m ột điểm đâng lưu ý đối với câc ADN polym erase, chúng tôi đê nhđn bản thănh côns đoạn gen 0,6 kb vă 2,7 kb bằng PCR sử dụng Pfu ADN pol. Tuy vậy, khi thừ nghiệm nhđn bản đoạn gen 4,8 kb vă 7,4 kb, chúng tôi thấy Pfu A D N pol nếu chỉ dùng độc lập (không có thím ADN polym erase khâc) lại không cho kết quả dươna tính (hình
20, cột 3 vă 6). Taq ADN polym erase có khả năng nhản bản đoạn 4,8 kb (hình 20. cột 2), nhưng không thể nhđn bản đoạn gen 7,4 kb (hinh 20, cột 5). Khi kết hợp 4 đơn vị T aq ADN pol với 1 đơn vị Pfu ADN pol trong phản ứng đê cho phĩp ch ú n2 tôi nhđn bản cả hai đoạn gen trín (hình 20, cột 4 vă 7). H iện tượng năy liín quan đến hoạt tính 3 ’-5 ’ exonuclease của Pfu ADN poỉ, khi có mặt c ù n2 với Tưcị ADN pol trong phản ứng thì enzym đê giúp loại bỏ những nucleotid bị đưa nhầm văo vă