Để gắn được gen pfu văo vector biểu hiện pET28a, trước hết chúnLỉ tỏi tiến hănh tâch gen pfu từ vector nhđn dòna (pCR2.1pfu) bằng câch xứ lý vector với hai enzym giới hạn lă N d e l vă Sư 11 ở hai vị trí đê được thiết k ế sẵn ở trẽn hai mỏi PFU-F vă PFU-R. V ector pET28a cũng được xử lý cùng với hai enzym trẽn. Sơ do thiết kế vector biểu hiện gen pfu được mô tả ở hình 7,
Hỗn hợp phản ứng cắt tâch gen pfu được ù ờ 37"c trong khoâng 2 giờ cho đến khi A D N được cắt hoăn toăn. Sản phẩm cât đươc điện di trín gel agarose đế định vị vă tâch riíng. Đoạn gen pfu vă pET28a được cắt bởi N d el vă Still sau đo được 2ên với nhau băng T4 ADN Iigase. Hỗn hợp phân ứng được ủ 16"c qua đĩm . dược biến nạp văo tế băo khâ biến E. còi D H 5 a vă cấy trai trín mói trường thạch LB có chứa kanam ycin. Đ ĩa cấy trăi được nuôi qua đĩm vă chúng tỏi dê thu được khâ nhiíu
ivgnien cưu san xuai enzym rju ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03
ivgnien cuu san xuai enzym r ju ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QƠTĐ.03.03
khuẩn lạc riíng rẽ. Trong câc khuẩn lạc năy chắc chắn có chứa vector pET28a nín tế băo mới có thể tồn tại trín m ồi trường có chứa kanam ycin. Chúng tòi đê chon ra 6 khuẩn lạc khâc nhau đânh số từ 1 đến 6 để kiểm tra nhanh sự có mặt của aen pfu
bằng PCR với cặp m ồi T7 prom oter vă PFU-R.
K ết quả PCR (được thể hiện trín ở hình 8) cho thấy tất cả câc khuẩn lạc 1- 6 (cột 1-6) đều xuất hiện câc bêng có kích thước tương đương với đoạn sen pfu (2.4 kb), điều đó cho thấy rằng câc khuẩn lạc năy có thể mang câc vector tâi tổ hợp.
Chúng tôi chọn câc khuẩn lạc dương tính ở trín cấy văo môi trường LB lỏns có chứa kanam ycin vă nuôi qua đím. Câc khuẩn lạc sau khi nuôi cđy được tâch thư ADN plasm id. Sản phẩm plasm id được điện di kiểm tra cùng với vector pET28a nguyín bản. K ết quả (được thể hiện ở hình 9) cho thấy câc băns của plasmid từ khuẩn lạc 1 đến 6 (cột 3-8) lă cao hơn câc bâng của plasm id pET28a nguyín bân (cột 1 vă 2). Do đó, khả nđng lớn câc plasm id năy chính lă vector pET28 m ans gen
pfu.
Ngnien cưu san xuêt enzym f j u ADN polymerase bang công nghệ ADN tâi rô’ hợp Đ ề tăi cấp trọng điềm, ĐHQGHN, M ê số: QƠTĐ.03.03
SjI I 11’«>|
r c o K 1 11^;>
KANr
xử lý bằng enzym giới hạn Safl vă Ndei
pET28a cât Sa/I
G T C G A C i
^ ^ ™ C A G C T * G 1
Gen pfu pET28a cắt NdeI
| C A T A T G ^ ^h
Gắn gen văo bằng T4 ADN ligase
- J-As-1
Hình 7. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen mê hoâ cho Pfu ADN polymerase trong vetcor pET2Sa
Chù trì đề tăi PGS.TS.Phan Tuấn Nghĩa, Khoa Sinh học, Trường Đai học Khoa hoc Tụ Shien 34
• ''Í/ H I ilt W -
ngrtien cuu san xuai enzym rju ADN polymerase bằng công nghệ ADN râi tổ hợp Đề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Ma số: QƠTĐ.03,03
k b M 1 ỉ ì I s I kb
H ình 8. Điện di sản phẩm kiểm tra câc khuẩn lạc băng PCR
Cột M: Thang ADN chuẩn 1kb Cột 1 - 6: C âc khuẩn lạc số 1 - 6
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 9. Điện di ADN plasmid tâch từ câc khuân lạc
Côt 1 - 2: V ector pET28a (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cột 3 - 8: ADN plasm id tâch từ câc khuẩn lạc số 1-6
Đ ể khẳng định điều năy chúng tòi chọn mõt mẫu plasm id tâch đươc ở trín, tiến hănh cắt kiểm tra lại bằng câc enzym fc o R I vă cắt phối hợp với Ncieỉ vă Scill
£cơ R I có m ột vị trí nhận biết trín gen pfu, vă một vị trí nhận biết trín pET28a. Tuy nhiẻn khi xử lý pET28a với N del vă SalI thì vị trí E co R l trẽn vector không còn. vì
vậy níu la vector tâi tô hợp thì khi xử lý với £ co R I, vector sẽ cắt m ở vòng vă có kích thước khoảng 7,7 kb. Đ iều năy đê được khẳng định qua kết quả ở hình 10 (cột 3).
K et qua điện di cũng cho thấy sau khi cất ADN plasm id từ khuẩn lạc trín băng hai enzym N d eI vă Sail thì xuất hiện một bêng ADN có kích thước văo khoảng 2,4 kb (hình 10, cột 4) tương đương với kích thước của gen pfu được nhđn bản với cặp mỏi T7 prom oter/PFU -R (hình 10, cột 5). N hư vậy, kết quả thu được nhờ điện di kiím tra trín gel agarose cho thấy răng plasm id năy mang gen pfu. Đến đđy. chún° tôi có thể khẳng định rang chúng tôi đê thiết k ế thănh côna vector biểu hiện pET28a m ang gen pfu, vă vector được ký hiệu lă pET28pfu.
ivgnien cưu san xuaỉ enzym f j u ADN polymerase bằng còng nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03
<b M 1 2 3 4 5 kb
Hình 10. Điện di sản phẩm cât kiểm tra plasmid có khả năng mun« gen pfu
băng câc enzym giói hạn
C ột M: Thang ADN chuẩn 1 kb. C ột 1: Plasmid pET28a Cột 2: Plasm id từ khuẩn lạc 1
Cột 3: Plasm id từ khuẩn lạc 1 được xử lí bằng EcoRI C ột 4: Plasm id từ khuẩn lạc 1 được xử lí bằng Ndè vă Sa/1
Cột 5: Sản phẩm PCR nhản đoạn gen mê hóa Pfu ADN pol từ genom e
3.3.2. Biểu hiện gen pfu trong vi khuẩn £ co li BL21(DE3)pLysS
Đ ể biểu hiện chúng tôi sử dụng chủng t ế b ă o £ . coli BL2K D E3). T rons nhiều trường hợp, protein tâi tổ hợp có gen gắn với prom oter 17 có thể được biểu hiện ngay câ khi vắng mặt của chất cảm ứng (IPTG) vă trở nín độc với tế băo. Tuy nhiĩn có thể kìm hêm sự biểu hiện protein tâi tổ hợp băng câch sử d ụ n s tế băo B L 21 í D E 3 )
ivgmen cuu san xuat enzym rju ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tô’ hợp Đề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê sô: QGTĐ.03.03_________________________
chứa pLysS. E. coli BL21(D E3)pLysS biểu hiện lysozym vă chính lysozvm ức chế sự biểu hiện câc protein từ vector pET nhờ khả năng liín kết vă lăm bất hoạt T7 A RN polym erase được biểu hiện ở mức thấp khi vắng mặt của chất cảm ứng. Sau khi tế băo vượt qua giai đoạn phât triển ban đầu vă có chất cảm ứng thì lượna T7 A RN polym erase têng nhiều vă vượt qua được sự ức ch ế của lysozvm (Lu & Erickson, 1997).
pET28pfu được biến nạp văo chủng E. coli BL21(DE3)pLysS. Sinh khối tế băo ở câc thời điểm khâc nhau (sau 1, 2, 3, 5 ,7 giờ cảm ứng bời IPTG) được thu nhận, hòa trong đệm chiết A, được phâ vỡ bằng siíu đm , sau đó xử lý nhiệt ờ 75"c trong 15 phút để biến tính vă kết tủa m ột số protein không mong muốn cũng như hạn ch ế sự phđn cắt của câc enzym proteolytic đối với Pfu ADN pol. Việc xử lý nhiệt dịch chiết lă dựa trín tính bền nhiệt cao của Pfu ADN pol như đê được nghiín cứu trước đđy (Lundberg et ơ i, 1991; Slater et al., 1998). Dịch chiết đươc thu lại bằng ly tđm vă kiểm tra mức độ biểu hiện Pfu ADN pol ở câc thời điểm khâc nhau bằng điện di trín gel polyacrylam id. Kết quả được thể hiện ở hình 11.
kDa M 1 2 3 4 5 6 7 kDí 97.0- .9 2 66.0- 45.0- 30.0- - ểỊ0t/fk 20.1- 14,4-
H ìn h ll. Điện di sản phẩm biểu hiện gen mê hoâ cho p fu ADN polymerase trong BL21(DE3) pLysS
Cõt M: thang protein chuẩn, cột 1: protein của E. co li B L 2 1 (D E 3 )p lys S
không m ang ve cto r tâi tổ hợp, cảm ứng sau 3 giờ. cột 2: protein của £.
coli B L21(D E 3)pLysS m ang vector tâi tổ hơp nhưng khòng đưoc cảm ứng.
cót 3 - 7: protein của E. coli B L21(D E 3)pLysS m ang vector tâi tổ hơp sau
1. 2, 3, 5, 7 giờ cảm ứng.
ivgruert cuu san xuai enzym r ju ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp
Đề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03_________________________
K ết quả điện di SDS-PAGE cho thấy chi câc dịch chiết tế băo m an? vector pET28pfu sau câc thời gian cảm ứng khâc nhau (hình 11, cột 3-7) lă có xuất hiện m ột băng protein mới với K LPT 92 kD a còn dịch chiết tí băo ở vi khuẩn không chứa vector tâi tổ hợp hay có chứa vector tâi tổ hợp nhưng không được cảm ÚT12 (hình 11, cột 1 vă 2) đều không xuất hiện băng protein năy. KLPT 92 kD a của bêng protein lă tương đương với K LPT của protein do gen pfu m ê hóa cộng với phần H is-Taa vă m ột số axit am in của vector pET28a. Bđng protein mới năy chỉ có sự khâc biệt rõ nĩt ở khoảng thời gian 1 giờ vă 2 giờ (hình 11, cột 3 vă 4) sau cảm ứng còn sau 3. 5. 7 giờ (hình 11, cột 5, 6, 7) không có sự thay đổi nhiểu về hăm lượng protein được biểu hiện so với sau 2 giờ.
Đ ể xâc định có phải lă Pfu ADN polym erase hay không, chúns tỏi dùna dịch chiết để kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với khuôn vă cặp mổi cho phĩp nhên bản đoạn gen có kích thước khoảng 0,6 kb.
K ết quả thu được ở hình 12 cho thấy sản phẩm PCR của phăn ứna chứa dịch chiết của vi khuẩn m ang vector tâi tổ hợp (cột 2) xuất hiện một bêns có kích thước như dự đoân (0,6 kb) trong khi đó dịch chiết của vi khuẩn không mang vector tâi tổ hợp không xuất hiện bâng năy (cột 1). Điều đó chứng tỏ trong dịch chiết của vi khuẩn mang vector tâi tổ hợp có hoạt tính của của Pfit ADN polym erase vă như vậy protein năy đê được biểu hiện thănh công.
b p M 1 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 12. Điện di săn phẩm kiếm tra hoạt tính của pfu ADN pol trong dịch chiết băng PCR
C ột M: Thang chuẩn ADN 1 kb. Cỗt 1: Dịch chiết của vi khuẩn khỏng mang vector tải tổ hơp C ột 2: Dịch chiết của vi khuẩn m ang vector tâi tổ hơp
ivgrueri cuu san xuat enzym r ju ADN polymerase bang công nghệ ADN tâi tổ hợp
Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ. 03.03
3.3.3. Tỉnh sạch Pfu ADN polymerase qua cột Ni-Agarose-NTA
Đ ể tinh sạch Pfu ADN polym erase chúng tỏi đê tiến hănh nuối cấy tế băo £.
coli m ang gen pfu bằng việc sử dụng hệ thống nổi lín m en (hình 13) vă thu tế băo nuôi cấy ở thời điểm 3 giờ sau cảm ứng IPTG như đê được kiểm tra ờ phần trín (hình 11).
M ột lít dịch tế băo lĩn m en được ly tđm để loại bỏ dịch môi trường. K ết tủa tỉ băo được hòa lại trong 20 mỉ đệm A. Dịch chiết sau đó được xử lý nhiệt ở 75°c trong 15 phút vă ly tđm ở 14.000 vòng/phút, 15 phút để loại bỏ một số protein kết tủa. Do Pfu A DN polym erase biểu hiện trong pET28 có mang trình tự H is-Tas ỡ đầu N của chuỗi polypeptid nín chúng tôi đê sử dụng bước sắc ký âi lực qua cột Ni- A garose. D ịch trín tủa được cho lỉn cột N i-Agarose (có kích thước cột 2el 1x6 cm) đê được cđn bằng vói đệm A. Câc protein không hấp phụ được rửa khỏi cột bằng cùng loại đệm . Phần protein gắn cột được đẩy ra băng dung dịch im idazol 250 mM pha trong cùng đệm A.
H ìn h 13. L ín m en sản x u ấ t P fu A DN p o ly m erase tâi tổ hơp
K ết quả kiểm tra độ sạch của chế phẩm thu được qua bước sắc ký qua cột Ni -A garose (hình 14) cho thấy dịch chiết đê xử lý nhiệt của tế băo có chứa nhiều bâng protein trong đó có bđng 92 kD a (hình 14, cột 1). Phần dịch khòng hấp phụ cột Ni- A garose có phổ băng tương tự như dịch chiết ban đầu. tuy nhiín không có băng 92 kD a (hình 14, cột 2). Phân protein gắn cột được đẩy ra băng im idazol 250 m \ l thđy
lygnien cưu san xuăt enzym Ffu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03
xuđt hiện m ột băng 92 kD a (hình 14, cột 3) ro nĩt. K ết quả chứng tỏ chế phẩm enzym thu được có độ sạch cao vă việc dùng cột N i-A garose lă thích hơp cho quâ trình tinh sạch.
Chúng tôi đê tiến hănh kiểm tra hoạt tính tổng hợp A D N của ch ế phẩm Pfu
A DN pol thu được băng PCR vă bằng phương phâp kĩo dăi oligo trong phức hợp T- p. K ít quả điện di sản phẩm PCR ở hình 15 cho thấy dịch chiết xử lv nhiệt (hình 15 cột 3) vă chí phẩm Pfu ADN pol qua cột N i-A garose (hình 15, cột 5) đểu có hoạt tính tổng hợp ADN trong PCR tương tự như ch ế phẩm Pfu ADN pol của Stratagene (hình 15, cột 2). Phẩn dịch không hấp phụ cột N i-A garose (hình 15, cột 4) khònợ có hoạt tính năy. kD a M 1 2 3 4 kDa 97- • 66- m. 4 5 - m 30- 2 0* 14,4-
Hình 14. Kiểm tra độ sạch của Pfu ADN polymerase sau khi qua cột Ni-Agarose trẽn SDS-PAGE
C ột M: Thang chuẩn protein
C ột 1: Dịch chiết của vi khuẩn mang ve cto r tâi tổ hợp sau 3 giờ cảm ứng C ột 2: Dịch không hấp phụ cột Ni a garose-N T A (Flow through)
C ột 3: Dịch đẩy ở nồng độ 250 mM im idazol C ột 4: P fu ADN pol qua cột H eparin-S epharose
Kết quả điện di sản phẩm phản ứna kĩo dăi oligo trong phức hợp T-P thinh 16, cột 4) cũng cho thđy chế phẩm PỊit ADN pol của Stratagene có băng ADN chạy chậm nhất chứng tỏ mồi trong T-P đê dược kĩo dăi thănh sợi kĩp có kích thước lớn hon p (hlnh 16, cột 1), T (hình 16, cột 2) hay phức hợp T-P (hình 16, cột 3) khi
không có ADN polym erase. Tương tự, dịch chiết xử lý nhiệt của tế băo (hình 15, cột 5), c h ế phẩm Pfu A D N pol qua cột N i-A garose (hình 16, cột 7) đều cho một băng chạy chậm nhất, chứng tỏ chúng đều có hoạt tính tổng hợp ADN polym erase. Phđn dịch không hấp phụ cột N i-A garose (hình 16, cột 6) chỉ cho một băng có vị trí tươns ứng với băng của phức hợp T-P khi không có enzym chứng tỏ khôn a có hoạt tính ADN polym erase.
bp M 1 2 3 4 5 6
ivgmen cuu san xuai enzym rju ADN polymerase bang công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Ma số: QGTĐ.03.03
750- 500-
Hình 15. Điện di sản phẩm kiểm tra hoạt tính của
Pfu ADN polymerase bằng PCR
Cột M: Thang ADN chuẩn 1 kb C ột 1: Đ ối chứng đm (H 20 ) C ột 2: Pfu ADN pol của Stratagene
C ột 3: Dịch chiết của vi khuẩn m ang vector tâi tô’ hơp sau 3 giờ cảm ứng C ôt 4: Dịch không hấp phụ cột N i-A garose (Flow through)
C ột 5: Pfu A D N pol đẩy ra ở nổng độ 250 mM im idazol
Cõt 6: P fu ADN pol qua cột H eparin-S epharose
3.3.4. Tinh sạch Pfu ADN polymerase qua cột Heparin-Sepharose 4B (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
N hằm một bước nữa nđng cao độ tinh sạch của chế phẩm pfu ADN pol. chúng tôi đê tiến hănh loại im idazol ra khỏi ch ế phẩm Pfu ADN pol thu được từ bước sắc ký âi lực qua cột N i-A garose ở trín, sử dụng centricon loại 30 kDa cât bỏ (30 kD a cut off) vă sắc ký ch ế phẩm enzym qua cột H eparin-Sepharose 4B. Phđn protein gắn trẽn cột được đẩv ra bêng dung dịch KCl ờ nónọ độ 500 mM pha trona
đệm A. Q ua bước sêc ký năy, Pfu ADN pol có m ặt ở phần dịch đẩy vă cũn ° chi có m ột băng protein trín SDS-PAGE vói kích thước 92 kD a (hình 14, cột 4) vă có hoạt tinh tong hợp A D N trong thi nghiệm nghiệm PCR (hình 15, côt 6) cũ n° như tron ° thí nghiệm kĩo dăi oligo trong phức hợp T-P (hình 16, cột 8). Như vậy chế phấm
Pfu ADN pol m ă chúng tôi thu được lă đê tinh sạch. K ết quả định lượn° protein cho thấy chúng tôi đê thu được khoảng 25 mg Pfu A D N pol tinh khiết từ 1 lit dịch nuôi cấy tế băo ban đầu, chiếm khoảng 15% protein dịch chiết tế băo sau khi xử lý nhiệt.
ivgnien cưu san xuai enzym r ju ADN polymerase bằng công ngliệ ADN tâi tổ hơp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Ma so: QGTĐ.03.03
Hình 16. Điện di sản phẩm kiểm tra hoạt tính của Pfu ADN pol trín gel polyacrylamid
C ột 1: Mối {30 nucleotid) C ột 2: Khuôn (62 nucleotid)
Cột 3: Hồn hợp phản ứng không có P fu ADN pol
CỘI 4: Hỗn hợp phăn ứng + P fu ADN pol của stra ta ge n e
C ột 5: Hỗn hợp phản úng + dịch chiết