Việc xâc định trình tự nucleotid của gen pfu được tiến hănh trín mây xâc định trinh tự ABI PRISM ® 3100-Avant. Câc cặp mồi sử dụng xâc định trinh tự lă M 13F vă M 13R (được cung cấp theo kit của vector nhđn dòng) vă PFU-2F vă PFU- 2R (được thiết k ế sau khi xâc định được trình tự đoạn đầu vă đoạn cuối của gen). M ục đích của thí nghiệm năy lă để xâc định xem gen pfu nhđn dòng có mang lỗi hay không cũng như có khả năng m ê hóa cho protein có hoạt tính hay khôn2. Kết quả xâc định trình tự gen pfu được nhđn dòng sẽ được so sânh với trình tự của sen
pfu đê được công bố trong ngđn hăng gen quốc tế ( D I2983) vă được thể hiện ở hình 6. K ết quả so sânh cho thấy, ngoăi phần trình tự của điểm nhận biết của N d el ờ đầu (CATATG) vă Sail (GTCGAC) ở cuối thì trình tự gen pfit m ă chúng tôi nhăn dòng được lă tương đổng 100% với trình tự gen pfu trong ngân hăng gen. Điều năy cũns khảng định về sự tương đổng 100% về trinh tự axit amin của enzym do gen m ê hoâ vă lă cơ sở để cho phĩp biểu hiện gen thănh protein có hoạt tính.
P f u , D 1 2 9 8 3 ,
12 2 3 4
C A TA TG A TTTTA G A TG TG G Ằ TTA C A TA A C TG A A G A A G G A A A A C CTG TTA TTA G G CTA TTC A T A A T G A T T T T A G A T0TG G A TT A C A T A A C T 0Ă A G A A G G A A A A C C TG TT A T7A G 3 C T -.T T C p f u , D 1 2 9 8 3 , 7 2 2 9 4 A A A A AA GAGAACGGAAAATTTAAGATAGAGCATGATAGAACTTTTAGAOCATACATTTAC AAAAAAGAGA A CG G A A A A TTTA A G ATA G A GCA TG A TAG A A CTTTTA G .-.CCA TA CA 7T7A C
P f u , D 1 2 9 8 3 ,
1 3 2 3 5 4
GCTCTTCTCAGGGA TG A TTCA A A G A TTG AA G A A G TTA AG A A A A TA A CG G GG G AkA G G :a t
GCTCTTCTCA G G G A TG A TTCA A A G A TTG A Ă G A A G TTA A G A A A A TA Ă C G GjGC-AAAJGCAT
p f u , D 1 2 9 8 3 , 1 9 2 4 1 4 GG A A AG A TTGTGAGAATTGTTGATGTAGAGAAGGTTGAGAAAaAIjT T rC TC C -.j 2 AĂG . . . g g a a a g a t t g t g a g a a t t g t t g a t g t a g a g a a g g t t g a g a a a ă a g t t t c t c3 3 C A Ă G :■ ;? p f u , D 1 2 9 8 3 , 2 5 2 4 7 4 A TT A C C G TG T G G A A A C TT TA TT TG G A A C A T C C C C A A G A TG T TC C C A C TA TT A j ; \ jrS-S-S-J-. ATTACCGTGTGGAAACTTTATTTGGAACATCCCCAAGATGTTCCCACrATTAG«G«AAAA
P E u , 3 1 2 GTTAGAGAACATCCAGCAGTTGTGGACATCTTCGAATACGATATTCCATTTGCAAAGAGA
D 1 2 9 8 3 , 5 3 4 GTTAGAGAACATCCAGCAGTTGTGGACATCTTCGAATACGATATTCCATTTGCAAAGAGA
t'tgmen cưu san xuai enzym rju ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03__________________
P E u, 3 7 2 TA C C TC A TC G A CA A A G G CC TAA TA CCA A TG G A G G GG G A A G A A G AG CTA A A G A TTCTTG C: D I 2 9 8 3 , 5 9 4 TA CCTCA TCG A CAAAGGCCTAATACCAATGGAGGGGGAAGAAGAGCTAAAGATTCTTGCC
p £ u , 4 3 2 TTCGA TA TA G A A ACCCTCTA TC A C G AA G G A G A A GA G TTTG G A A A A G G CC C A ATTA TAA TJ D I 2 9 8 3 , 6 5 4 TTCGATATAGAAACCCTCTA TCA CG AA G G A G A A GA G TTTG G A A A A G G CCCA ATTA TAA TG
P f u , 4 9 2 A TTA GTTA TGCA G A TG A A A A TG A A G CA A A G G TG A TTA CTTG G A A AA A CA TA G A TCTTCCA D 1 2 9 8 3 , 7 1 4 A TTA G TTA TG C A G A TG A A A A TG A A G CA A A G G TG A TTA CTTG G A A AA A CA TA G A TCT7CCA
P f u , 5 5 2 TACGTTGAGGTTG TA TCA A G CG AG A G A G A G A TG A TA A A G A GA TTTCTCA G G A TTA TCA GG D 1 2 9 8 3 , 7 7 4 TA CG TTG AGGTTGTATCAAGCGAGAGAGAGATGATAAAGAGATTTCTCAGC-ATTATCAGG
p E u , 6 1 2 G A G A A G G A TC C TG A C A TTA TA G TTA C TT A TA A TG G A G A C T C A T TC G A C T TC C C A T A T TT A D 1 2 9 8 3 , 8 3 4 G A G A A G G A TC C TG A C A TTA TA G TTA C TT A TA A TG G A G A C T C A T TC G A C T TC C C A T A T TT A
p íu , 6 7 2 G CGA A A A G G G CAGAAAAACTTGGCATTAAATTAACCATTGGAAGAGATGGAAG'rCAG'y:c
D I 2 9 8 3 , 8 9 4 GCGAAAAGGGCAGAAAAACTTGGGATT A A A T TA A CCA TTG G A A G AG A TG GA A G CG A GCC:
p f u , 7 3 2 AAGATGCACAGAATAGGCGATATCACGGCTGTAGAAGTCAAGGGAAGAATAl’A T T T ';' 3AC D 1 2 9 8 3 , 9 5 4 AAGATGCAGAGAATAGGCGATATGACGGCTGTAGAAGTCAAGGGAAGAATACATTTCGAC
P f u . 7 9 2 TTG TA TCA TG TA ATA A CA A G G A CA A TA AA TCTC CC A A CA TA CA C A CTA G A GG C TG TA T.-.T D 1 2 9 8 3 , 1 0 1 4 T T G T A TC ATGTAATAACAAGGACAAT A A A TC TC C CAAC AT AC AC AC TA JAG 'J r . jTA : :
p f u , 8 5 2 GAAGCÊATTTTTGGAAĂGCCAAAGGAGAĂGGTATACGCCGACGAGATAGCAAAAGCCT C-G D 1 2 9 8 3 , 1 0 7 4 GAAGCAATTTTTGGAAAGCCAAAGGAGAAGGTATACGCCGACGAGATAGCAA/-J-.; " 3 P f u , 9 1 2 G A A A GTG G AGAGAACCTTGAGAGAGTTGCCAAATACTCQATGGAAGAT C-CAAA3G C A A ;t D 1298 3 , 1 1 3 4 GAAAGTGGAGAGAACCTTGAGAGAGTTGCCAAATACTCGATGGAAGA7GCAAAG j ' J zz P E u , 9 7 2 TA TG A A C TC G G G A A A G A A T TC C T TC C A Ằ - 5 G A A A 7 T C A G C T 7 T C A A 3 A 7 7 .-. j T 7 J i k ’Z k .- D 1 2 9 8 3 , 1 1 9 4 T A T G A A C T C G G G A A A G A A T T C C T T C C A A T G G A A A T T C A 3C IT T C A A - ATT.-’-.3 7 7 ; "A
P f u , 1 0 3 2 CCTTTA TG G G ATG TTTC A A G G TCA A G C A CA G G G A A CC TTG TA G A G TG G TTCTTA C T7A C -G D 1 2 9 8 3 , 1 2 5 4 C C T T T A TG G G A T G TT TC A A G G T C A A G C A C A G G G A A C C TT G TA G A G TG G TT C T TA C TT A G J
Ii&mcn LUU sun XUUI cruym rju ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tô’ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03______________ ___
p f u , 1 0 9 2 AAAGCCTACGAAAGAAACGAAGTAGCTCCAAACAAGCCAAGTGAAGAGGA :-TA T ; AAAGA 0 1 2 9 8 3 , 1 3 1 4 AAAGCCTACGAAAGAAACGAAGTAGCTCCAAACAAGCCAAGTGAAGAGGAGTATCAĂĐGA
P f u , 1 1 5 2 A G G CTCA G G G A G A G CTA CA CA G GTG G A TTCG TTA A AG A G CCA G A A A A 3G G GTT" Ĩ G 3AA D 1 2 9 8 3 , 1 3 7 4 A G G CTCAGGGAGAGCTACACAGGTGGATTCGTTAAAGAGCCAGAAAAGGGGTTGTG3 C-AA p f u , 1 2 1 2 A A C A T A G T A T A C C T A G A T T T T A G A G C C C T A T A T C C C T C G A T T A T A A T T A C C C A ;A A T G T T D 1 2 9 8 3 . 1 4 3 4 A A C A T A G TA TA C C TA G A TTT TA G A G C C C TA T A T C C C TC G A TT A TA A TT A C C C A C A A TG T T p f u , 1 2 7 2 TCTCCCG ATA CTC TA A A TC TTG A G G G A TG C A A G A A C TA TG Ă TA TC G CTC CTCA A G TA G G C D 1 2 9 8 3 , 1 4 9 4 TCTCC C G A TA CTC TA A A TC TTG A G G G A TG C A A G A A C TA TG A TA TC G CTC CTCA A G TA G G C P f u , 1 3 3 2 C A CA A G TTCTG CA A G G A C A TC C C TG G T TTT A TA C C A A G TC T C T TG G G A C A T TTG T TA G A G D I 2 9 8 3 , 1 5 5 4 C A CA A G TT C T G C A A G G A C A T C C C TG G T TTT A TA C C A A G TC T C T TG G G A C A T TTG T TA C Ă J P f u . 1 3 9 2 G A A A GA C A A A A GA TTAAGACAAAAATGAAGGAAACTCAAGATCCT«TA<3AAAAAATAt;r'; D 1 2 9 8 3 , 1 6 1 4 GAAAGACAAAAGATTAAGACAAAAATGAAGGAAACTCAA<ÌA T C C T A T A G A A A A A A T A f' p f u , 1 4 5 2 C T T G A C T A T A G A C A A A A A G C G A T A A A A C T C T T A G C A A A T T C T T T C T -A C 0G A T A 17A rooc D I 2 9 8 3 , 1 6 7 4 CTTGA CTA TA GA CA A A A AG CG A TA A A A CTCTTA O CA A A rT C T T T C T .-.C JT -A : AT TA 7'J
P E u . 1 5 1 2 t a t g c a a a a g c a ă g a t g g t a c t^t a a g g ă g t g t g c t g a g a g c g t: ACTGC~T'~ :• :"AĐ'3A D 1 2 9 8 3 , 17 3 4 TATGCAAAAGCAAGATGGTACTGTAAGGAGTGTGCTC-AIJAGCGTTA ; 7 '.C C T • G‘yỉĐAGA p E u , 1 5 7 2 A A G TA CA TCG AG TTA G TA TGG Ê A G G A G CTCG A A G A A Ă A GTTTG GA T17AAA r. : -- z : D I 2 9 8 3 , 1 7 9 4 A A G TA C A TC G A G TTA G TA TGG A A G G A G CTCG A A 3A A A A GTTTG GA TTTAA A :-T : : T ~ T A : p £ u , 1 6 3 2 A TT G A C A C TG A TG G T C T C T A TG C A A C T A T C C C A G G A G G A 3A A A 3T G A G 3A A A . A A A 3AAA D12 9 8 3 , 18 54 ATTGACACTGATGGTCTCTATGCAACTATC ; CA 3 C- 3A 3.---.3TG.-.G 7.---.
p f u 1 6 9 2 AAGGCTCTAGAATTTGTAAAA : AC A : AAA - - "A A A 3 : T c c c - :: T. . V3A Z- : - - :;A
D I 2 9 8 3 , 1 9 1 4 AAGGCTCTAGAA TTTC-TA A A ATA CA TA Ă ATT^.V --A G rTCCCTOC-A - 7 :: . : : :
p f u , 1 7 5 2 TATGAAGGGTTTTATAAGAGGGGATTCTTCGTTACGAAGAAGAGGTATGCAGTAAT.ỊC-AT D 1 2 9 8 3 , 1 9 7 4 TA TG A A G G G TTTTA TA A G AG G G G A TTCTTCG TTACG A A G A AG A G G TA TG CA G TA A TA GA T p f u , 1 8 1 2 GAAGAAGGAAAAGTCATTACTCGTGGTTTAGAGATAGTTAGGAGAGATTC-GAGTGAAĂTT D 1 2 9 8 3 , 2 0 3 4 GAAGAAGGAAAAGTCATTACTCGTGGTTTAGAGATAGTTAGGAGAGATTGCAGTGAAATT P f u . 1 8 7 2 GCAAAAGAAACTCAAGCTAGAGTTTTGGAGACAATACTAAAACACGGAGĂTGTrC-AĂGAA D 1 2 9 8 3 , 2 0 9 4 GCAAAAGAAACTCAAGCTAGAGTTTTGGAGACAATACTAAAACACGGAGATOTTGAĂGAA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
P E u , 1 9 3 2 GCTGTG A G A A TA G TA A A A G A AG TA A TA CAA A A G CTTG CCA A TTA TG AĂ A TTc c A C CAGAG D I 2 9 8 3 , 2 1 5 4 G C TG TG A G A A TA G TA A A A G A AG TA A TA CAA A A G CTTG CCA A TTA TG AA A TTCCA C:.A3A G
P E u , 1 9 9 2 A A G C T C G C A A TA T A T G A G C A G A TA A C A A G A C C A TTA C A TG A G TA TĐ A 3G C G A rA G 3T C :t
D 1 2 9 8 3 , 2 2 1 4 AAGCTCGCAATATATG AGCAGATAACAAG AC CATT AC AT GAGTĐTAA ',G C 3A TA •; T c ÍT
P E u , 2 0 5 2 C A CG TAG C TGTTGCAAAGAAACTAGCTGCTAAAGGAGTTAAAATAj\AGCCAGGAATGGTA D 1 2 9 8 3 , 2 2 7 4 CACGTAGCTGTTGCAAAG A A A CTA G CTG CTA A A GG A G TTA A A ATA A A GC:A G G .--A T'3G TA
P f u , 2 1 1 2 A TT G G A T A C A T A G T A C T TA G A G G C G A T G G TCC A A TTA G C A A TA G G G C A A TTC TA fi'tT'jA ''? D 1 2 9 8 3 , 2 3 3 4 ATT'G GATACA TA G TA CTTA GA G G CG A TG G TCCAA TTA G CAA TA' j!J Ơ JA A T TC TA J ’.'TGA*
P f u , 2 1 7 2 G A A TACGATCCCAAAAAGCACAAGTATGACGCAGAATATTACATTGAGAA : ÍO T TC TT D 1 2 9 8 3 , 2 3 9 4 G A A TA CG ATCCCAAAAAGCACAAGTATGĐCGCAGĂATATTA :ATT'"JAGA.-\ : VA' ~,TT'":TT
p f u , 2 2 3 2 C CA G C G G TA C TTA G G A TA TTG G A G G G A TTTG G A TA C A G A A A G G A A G A C -7':.-. TA D i 2 9 8 3 , 2 4 5 4 C CA G CGGTACTTAGGATATTGGAGGGATTTGGATACAGAAAGi ỈAAGAC :T
p f u , 2 2 9 2 A A G A CA A G A CA A G TCG G C CTA A CTTC C TG GCTTAAC ATTAAAAAATC : T ; , ;-.V- : D 1 2 9 8 3 , 2 5 1 4 A A G A C A A G A C A A G TCG G C CTA A CTTC C TG G CTTĂ A : A T T A A A A A A r: : T A G : : " 7 1 : A :
Wghien cưu san xuêt enzym Ffu AD N polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03__________________
Hình 6. Kết quả so sânh trìn h tự nucleotid cúa gen pfu
Pfu: Trình tự gen p fu nhđn dong đươc trong pCR2.1
D12983: Trinh tự g e n p fu trong Ngđn hang gen Quốc tế
3.3. THIẾT KẾ VECTOR Biểu HIỆN GEN MÊ HÓA PFU ADN POLYMERASE
H ệ thống vector pET lă m ột trong câc hệ vector được sử dụng phổ biến nhất cho việc nhđn dòng vă biểu hiện câc protein tâi tổ hợp ở E. coli. pET28a lă vector được chúng tôi lựa chọn cho việc biểu hiện gen pfu. Trín thực tế, ban đầu chúns tôi đê thử nghiệm qui trình biểu hiện gen pfu trong vetcor p E T l 1 như dược mô tâ bởi Lu vă Erickson (1997). Tuy nhiín sau rất nhiều lần thử nghiệm chúng tôi đê không thu được vector biểu hiện m ang gen pfu. Bản thđn vector p E T l 1 chứa ít điểm cắt của enzym giới hạn, vì thế câc tâc giả năy chỉ thiết k ế m ột điểm cắt N d el tro ns mồi nhđn gen. G en sau đó phải đưa văo vector T7pBbueT để lợi dụng một điểm cât Nclel
của vector năy. Do chỉ dùng m ột enzym N d eỉ để đưa sen văo vector pE T l 1. nẽn xâc suất gen bị lắp ngược rất cao, m ất thời gian chọn lọc. Hơn nữa, vector năy khôn2 m ang trình tự 6xH is nín việc tinh sạch lă phức tạp hơn. Từ thực tế đó, chúng tỏi đê lựa chọn vector pET28a. V ector năy có nhiều điểm cắt của enzvm giới hạn trong vùng nhđn dòng hơn p E T ll. Ngoăi ra, pET28a có m ang thím trình tự His-Taơ đế tạo điều kiện thuận lợi cho quâ trinh tinh sạch enzym Pfu ADN pol được biếu hiện. Do đểu thuộc hệ thống vector pET, sự biểu hiện của gen đích ở pET28a dược kiểm soât bới prom oter T7 (của thực khuẩn thể T7) vă T7 ARN polym erase. Đây lă một prom oter khỏe, sản phẩm biểu hiện của gen đích có thể lẻn tới hơn 50% tổng số protein được tổng hợp của tế băo (Studier et a i, 1986; 1990). Chính vì vậy. khi sân phẩm của gen đích lă độc với tế băo vă nếu không có biện phâp lăm chậm sự biếu hiện của gen đích thì tế băo bị chết ngay ở giai đoạn ban đầu.
3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen pfu vă biến nạp văo £ coli
Để gắn được gen pfu văo vector biểu hiện pET28a, trước hết chúnLỉ tỏi tiến hănh tâch gen pfu từ vector nhđn dòna (pCR2.1pfu) bằng câch xứ lý vector với hai enzym giới hạn lă N d e l vă Sư 11 ở hai vị trí đê được thiết k ế sẵn ở trẽn hai mỏi PFU-F vă PFU-R. V ector pET28a cũng được xử lý cùng với hai enzym trẽn. Sơ do thiết kế vector biểu hiện gen pfu được mô tả ở hình 7,
Hỗn hợp phản ứng cắt tâch gen pfu được ù ờ 37"c trong khoâng 2 giờ cho đến khi A D N được cắt hoăn toăn. Sản phẩm cât đươc điện di trín gel agarose đế định vị vă tâch riíng. Đoạn gen pfu vă pET28a được cắt bởi N d el vă Still sau đo được 2ên với nhau băng T4 ADN Iigase. Hỗn hợp phân ứng được ủ 16"c qua đĩm . dược biến nạp văo tế băo khâ biến E. còi D H 5 a vă cấy trai trín mói trường thạch LB có chứa kanam ycin. Đ ĩa cấy trăi được nuôi qua đĩm vă chúng tỏi dê thu được khâ nhiíu
ivgnien cưu san xuai enzym rju ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03
ivgnien cuu san xuai enzym r ju ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QƠTĐ.03.03
khuẩn lạc riíng rẽ. Trong câc khuẩn lạc năy chắc chắn có chứa vector pET28a nín tế băo mới có thể tồn tại trín m ồi trường có chứa kanam ycin. Chúng tòi đê chon ra 6 khuẩn lạc khâc nhau đânh số từ 1 đến 6 để kiểm tra nhanh sự có mặt của aen pfu
bằng PCR với cặp m ồi T7 prom oter vă PFU-R.
K ết quả PCR (được thể hiện trín ở hình 8) cho thấy tất cả câc khuẩn lạc 1- 6 (cột 1-6) đều xuất hiện câc bêng có kích thước tương đương với đoạn sen pfu (2.4 kb), điều đó cho thấy rằng câc khuẩn lạc năy có thể mang câc vector tâi tổ hợp.
Chúng tôi chọn câc khuẩn lạc dương tính ở trín cấy văo môi trường LB lỏns có chứa kanam ycin vă nuôi qua đím. Câc khuẩn lạc sau khi nuôi cđy được tâch thư ADN plasm id. Sản phẩm plasm id được điện di kiểm tra cùng với vector pET28a nguyín bản. K ết quả (được thể hiện ở hình 9) cho thấy câc băns của plasmid từ khuẩn lạc 1 đến 6 (cột 3-8) lă cao hơn câc bâng của plasm id pET28a nguyín bân (cột 1 vă 2). Do đó, khả nđng lớn câc plasm id năy chính lă vector pET28 m ans gen
pfu.
Ngnien cưu san xuêt enzym f j u ADN polymerase bang công nghệ ADN tâi rô’ hợp Đ ề tăi cấp trọng điềm, ĐHQGHN, M ê số: QƠTĐ.03.03
SjI I 11’«>|
r c o K 1 11^;>
KANr
xử lý bằng enzym giới hạn Safl vă Ndei (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
pET28a cât Sa/I
G T C G A C i
^ ^ ™ C A G C T * G 1
Gen pfu pET28a cắt NdeI
| C A T A T G ^ ^h
Gắn gen văo bằng T4 ADN ligase
- J-As-1
Hình 7. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen mê hoâ cho Pfu ADN polymerase trong vetcor pET2Sa
Chù trì đề tăi PGS.TS.Phan Tuấn Nghĩa, Khoa Sinh học, Trường Đai học Khoa hoc Tụ Shien 34
• ''Í/ H I ilt W -
ngrtien cuu san xuai enzym rju ADN polymerase bằng công nghệ ADN râi tổ hợp Đề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Ma số: QƠTĐ.03,03
k b M 1 ỉ ì I s I kb
H ình 8. Điện di sản phẩm kiểm tra câc khuẩn lạc băng PCR
Cột M: Thang ADN chuẩn 1kb Cột 1 - 6: C âc khuẩn lạc số 1 - 6
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 9. Điện di ADN plasmid tâch từ câc khuân lạc
Côt 1 - 2: V ector pET28a
Cột 3 - 8: ADN plasm id tâch từ câc khuẩn lạc số 1-6
Đ ể khẳng định điều năy chúng tòi chọn mõt mẫu plasm id tâch đươc ở trín, tiến hănh cắt kiểm tra lại bằng câc enzym fc o R I vă cắt phối hợp với Ncieỉ vă Scill
£cơ R I có m ột vị trí nhận biết trín gen pfu, vă một vị trí nhận biết trín pET28a. Tuy nhiẻn khi xử lý pET28a với N del vă SalI thì vị trí E co R l trẽn vector không còn. vì
vậy níu la vector tâi tô hợp thì khi xử lý với £ co R I, vector sẽ cắt m ở vòng vă có kích thước khoảng 7,7 kb. Đ iều năy đê được khẳng định qua kết quả ở hình 10 (cột 3).
K et qua điện di cũng cho thấy sau khi cất ADN plasm id từ khuẩn lạc trín băng hai enzym N d eI vă Sail thì xuất hiện một bêng ADN có kích thước văo khoảng 2,4 kb (hình 10, cột 4) tương đương với kích thước của gen pfu được nhđn bản với cặp mỏi T7 prom oter/PFU -R (hình 10, cột 5). N hư vậy, kết quả thu được nhờ điện di kiím tra trín gel agarose cho thấy răng plasm id năy mang gen pfu. Đến đđy. chún° tôi có thể khẳng định rang chúng tôi đê thiết k ế thănh côna vector biểu hiện pET28a m ang gen pfu, vă vector được ký hiệu lă pET28pfu.
ivgnien cưu san xuaỉ enzym f j u ADN polymerase bằng còng nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03
<b M 1 2 3 4 5 kb
Hình 10. Điện di sản phẩm cât kiểm tra plasmid có khả năng mun« gen pfu
băng câc enzym giói hạn
C ột M: Thang ADN chuẩn 1 kb. C ột 1: Plasmid pET28a Cột 2: Plasm id từ khuẩn lạc 1
Cột 3: Plasm id từ khuẩn lạc 1 được xử lí bằng EcoRI C ột 4: Plasm id từ khuẩn lạc 1 được xử lí bằng Ndè vă Sa/1
Cột 5: Sản phẩm PCR nhản đoạn gen mê hóa Pfu ADN pol từ genom e
3.3.2. Biểu hiện gen pfu trong vi khuẩn £ co li BL21(DE3)pLysS (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đ ể biểu hiện chúng tôi sử dụng chủng t ế b ă o £ . coli BL2K D E3). T rons nhiều trường hợp, protein tâi tổ hợp có gen gắn với prom oter 17 có thể được biểu hiện ngay câ khi vắng mặt của chất cảm ứng (IPTG) vă trở nín độc với tế băo. Tuy nhiĩn có thể kìm hêm sự biểu hiện protein tâi tổ hợp băng câch sử d ụ n s tế băo B L 21 í D E 3 )
ivgmen cuu san xuat enzym rju ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tô’ hợp Đề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê sô: QGTĐ.03.03_________________________
chứa pLysS. E. coli BL21(D E3)pLysS biểu hiện lysozym vă chính lysozvm ức chế sự biểu hiện câc protein từ vector pET nhờ khả năng liín kết vă lăm bất hoạt T7 A RN polym erase được biểu hiện ở mức thấp khi vắng mặt của chất cảm ứng. Sau khi tế băo vượt qua giai đoạn phât triển ban đầu vă có chất cảm ứng thì lượna T7 A RN polym erase têng nhiều vă vượt qua được sự ức ch ế của lysozvm (Lu & Erickson, 1997).
pET28pfu được biến nạp văo chủng E. coli BL21(DE3)pLysS. Sinh khối tế băo ở câc thời điểm khâc nhau (sau 1, 2, 3, 5 ,7 giờ cảm ứng bời IPTG) được thu nhận, hòa trong đệm chiết A, được phâ vỡ bằng siíu đm , sau đó xử lý nhiệt ờ 75"c trong 15 phút để biến tính vă kết tủa m ột số protein không mong muốn cũng như hạn ch ế sự phđn cắt của câc enzym proteolytic đối với Pfu ADN pol. Việc xử lý nhiệt dịch chiết lă dựa trín tính bền nhiệt cao của Pfu ADN pol như đê được nghiín cứu trước đđy (Lundberg et ơ i, 1991; Slater et al., 1998). Dịch chiết đươc thu lại bằng ly tđm vă kiểm tra mức độ biểu hiện Pfu ADN pol ở câc thời điểm khâc nhau bằng điện di trín gel polyacrylam id. Kết quả được thể hiện ở hình 11.
kDa M 1 2 3 4 5 6 7 kDí 97.0- .9 2 66.0- 45.0- 30.0- - ểỊ0t/fk 20.1- 14,4-
H ìn h ll. Điện di sản phẩm biểu hiện gen mê hoâ cho p fu ADN polymerase trong BL21(DE3) pLysS
Cõt M: thang protein chuẩn, cột 1: protein của E. co li B L 2 1 (D E 3 )p lys S