2.2.1. Phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase (PCR)
Trong nghiín cứu năy, kỹ thuật PCR được sứ d u n s với câc mục đích khâc nhau: để nhđn bản gen m ê hóa Pfu ADN polym erase từ genom e, kiểm tra sự có măt của ADN đích trong câc mẫu khâc nhau, đânh giâ hoạt độ ton s hợp ADN cùa enzym hay để nhđn bản câc đoạn gen có kích thước khâc nhau.
Nghiín cứu sân xuêt enzym Pfu AD N polymerase bằng công nghệ AD N tâi tổ hợp Đ ể tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03______________
Thănh phần phản ứng nhđn bản đoạn gen m ê hóa Pfu A D N polym erase bằng PCR từ A DN genom e của P yrococcus fu rio su s bao gồm:
dH20 16,1 ul
Đệm 10X 2,5 ni
PFU-F (25 ng/Ịi.1) l ị i ì
PFU-R (25 ng/ịil) l ụ i
dNTPs 25 mM 0,4 ui
Tac/ +Tgo ADN polymerase của Rochc 1 ịil
ADN genome lăm khuôn (20 ng) 3 u l
Tổng thể tích 25 nl
Sau khi trộn đều câc thănh phẩn phản ứng, PCR được thực hiện trín mây PCR 9700 (Perkin Elmer). C hế độ nhiệt cho phản ứng: 94°C-4 phút để khởi động nóng, tiếp theo lă 30 chu kỳ của 3 bước: 94°C-30 giđy để lăm biến tính ADN, 55°C- 30 giđy để gắn mồi vă 72°C-2 phút 30 giđy để kĩo dăi chuỗi. Mẫu được ủ tiếp ở 72uc trong 7 phút vă giữ ở 4 °c cho đến khi phăn tích. Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra bằng điện di trín gel agarose 1% với chất nhuộm ADN lă ethidium bromide (EtBr).
Trong trường hợp PCR được sử dụng để đânh giâ hoạt độ tổng hợp ADN của
Pfu ADN pol, thì phản ứng được tiến hănh tương tự, cụ thể thănh phần phản ứng gồm: 3-5 ng ADN khuôn lă đoạn gen 0,6 kb của vector pET28a, 2,5 fil đệm phản
ứng lOx, dNTP mỗi loại 0,4 mM , 25 ng m ồi pET28F (5 ’-
GAATGAGGGCATCGTTCC) vă 25 ng m ồi pET28R (5 ’-
GTCCTCGCCGAAAATGAC), 2,5 đơn vị Pfu A DN polym erase. C hế độ nhiệt cho phản ứng 94°C-4 phút để khởi động nóng, tiếp theo lă 30 chu kỳ của 3 bước: 94°C- 30 giđy để lăm biến tính ADN, 56°C-30 giđy để gắn m ồi vă 72°C-30 giđy để kĩo dăi chuỗi. M ẫu sau đó được ủ tiếp ở 72°c trong 7 phút vă giữ ở 4 °c cho đến khi phđn
Ngoăi ra, PCR còn được thực hiện với ADN hệ gen vi khuẩn E nviìúa cơrotovorỉna lăm khuôn, sử dụng cặp mồi 1951F (5 ’-
CTTGCTGTGGTGTTGCTACrC) vă 6759R (5’-TTTTGCAGCGCCATGTAGTC)
để nhăn đoạn gen 4,8 kb vă cặp mồi 1951F vă 9406R (5 ’-
G CAG TG TTCTCA GCG TTAG G) đển nhđn đoạn gen 7,4 kb. Trong trường hợp năy.
Nghiín cứu sản xuất enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03________
câc điểu kiện về cơ bản lă như được m ô tả ở trín, riíng nhiệt độ gắn mồi lă 62 °c nhiệt độ kĩo dăi chuỗi lă 68°c, thời gian kĩo dăi chuỗi lă 1 phút cho lk b ADN cần nhđn bản.
2.2.2. Gắn săn phẩm PCR văo vector pCR2.1
Câc sản phẩm PCR nhđn gen pfu, có băng đúng kích thước trín gel điện di agarose, được gắn trực tiếp văo vector nhđn dòng pCR2.1. Cơ sở của phản ứne lă dựa trín khả năng gắn thím m ột gốc adeninosin m onophosphat (A) ở đầu 3 ’ của sản phẩm nhờ hoạt tính term inal transferase không phụ thuộc văo trình tự ADN khuôn của Taq ADN polym erase. Trong khi đó vector nhđn dòng pCR2.1 m ạch thẳng được thiết k ế có chứa gốc thym idin m onophosphat (T) ở đầu 3 ’ vă kỉm theo enzvm topoisom erase, tạo nín khả năng liín kết bổ sung A-T giữa vector vă sản phẩm. Phản ứng được thực hiện theo hướng dẫn của kit với 2 J^1 sản phẩm PCR cho một phản ứng. H ỗn hợp phản ứng gắn được ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút sau đó dược giữ tại 4 °c trong thời gian chuẩn bị được biến nạp văo tế băo khả biến.
2.2.3. Biến nạp plasmid văo tế băo £ coỉi
T ế băo khả biến E. coli chủng T O PIO F’ được cung cấp theo kit nhăn dòng của hêng Invitrogen. Q uâ trình biến nạp plasm id văo tí băo vi khuẩn E. coỉi được thực hiện như được mô tả trong bản hướng dẫn của kit. Hỗn hợp biến nạp sau đó được cấy trải trín đĩa petri chứa môi trường Luria-Bertani (LB) có kanam ycin 50 ịig/ml, 20 jul X -gal 20 m g/m l vă 20 JJ.1 IPTG 100 m M đê được gạt đểu trẽn mặt thạch. Câc tế băo được nuôi trong tủ ấm 3 7 °c qua đím.
Trong m ột số trường hợp cần chọn vector biểu hiện tâi tổ hợp hoặc đưa vector biểu hiện đê mang gen pfu văo tế băo chủng biểu hiện BL21(D E3)-LvsS thì câc tế băo khả biến được chuẩn bị theo qui trinh dưới đđy:
- T ế băo E. coli được nuôi qua đím trong 1 ml mỏi trường LB lỏng.
- Pha loêng huyền dịch tế băo đê nuôi cấy theo ti lệ 1/100 trong 50 ml mói trường LB. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nuôi lắc ở 30°c, 200 vòng/phút đến khi A 600= 0,4.
- Ly tđm thu sinh khối ở 4°c, tốc độ 2300 - 2500 vòng/phút, trons 10 phút.
- H òa lại tủa tế băo trong đệm (10 mM Tris- HC1 pH 7,0; 60 mM C a C k 250 miM KC1) đê được khử trùng vă lăm lạnh.
Đ A I H O C Q L 31 A M.', N O ' ị TRUNG TĐM ~ ~ /y / r TIN ' V — I
D r / ỏ ' ữ
ivgnien cưu san xuai enzym Pfu ADN polymerase bằng cõng nghệ ADN râi tổ hợp Để tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03_______
- ủ trín đâ 10 phút.
- Ly tđm 2500 vòng/phút, 10 phút ở 4°c.
- H òa tủa tế băo trở lại trong 4 ml đệm ở trín sau đó bổ sung 0,3 ml dim ethyl sulfoxide (DMSO).
- ủ trín đâ 10 phút. Dung dịch tế băo sẵn săng dùng cho biến nạp hoặc có thể được lăm đông lạnh trong nitơ ỉỏng vă cất giữ ở -8 0 °c đến khi dùns.
Q uâ trình biến nạp tương tự như ở trín, tuy nhiín với vector biểu hiện pET28a mang gen pfu thì trong môi trường LB không cần bổ sung X-gal vă IPTG.
2.2.4. Tâch ADN plasmid từ vi khuẩn £ colỉ
ADN plasm id được tâch theo phương phâp được mỏ tả trong (Sam brook et a Ị
1989) hoặc sừ dụng kit tâch ADN plasm id của hêng Q iagen. ADN sau đó được hoă tan trong một thể tích nhỏ đệm TE hoặc H 20 cất loại ion khử trùng.
2.2.5. Tâch ADN từ gel điện di agarose
Câc băng ADN sau khi chạy điện di trín gel agarose được soi dưới đỉn u v để định vị băng vă băng quan tđm được tâch ra bằng kit Easytrap™ Ver 2.
2.2.6. Xâc định trĩnh tự nucleotid của gen
Trình tự nucleotid của gen m ê hóa cho Pfu ADN polym erase dược xâc định theo phương phâp của Sanger (Sambrook et a i , 1989). Đặc trim s của phương phâp năy lă ngoăi những dN TP thông thường còn sử dụng thím 4 loại điđeoxynuekotiđ (ddNTPs) trong đó nhóm 3 ’-OH đê bị loại oxy chì còn lă 3 ’-H, mỗi loại được đânh dấu bằng chất phât huỳnh quang đặc trưn2 khâc nhau. Sự có mặt của câc đdNTP sẽ lăm mất khả năng hình thănh câc cầu nối phosphodieste với câc nucleotid tiếp theo dẫn đến lăm ngừng quâ trình tổng hợp ADN. Câc đoạn ADN có kích thước khâc nhau một nucleotid được phăn tâch bằng diện di m ao quan vă phât hiện bằng hỉ thống phên tích tự động nhờ mây giải trình tự 3100-A vant Genetic A n a lv s e r.
2.2.7. Điện di ADN trẽn gel agarose
Gel agarose được chuẩn bị trong đệm TBE 0.5X. nhuĩis có nồng độ EDTA 1 - 2 mM để trânh sự phăn cắt ADN bởi nuclease. Mầu ADN được trộn với đím chấm m ẫu có chứa sẵn ethidium brom ide 50 ịig/ml, điện di được tiến hănh với điện th ế ổn
định khoảng 10 volt/cm gel. Sau khi kết thúc điện di bản gel được lấy ra soi dưới ânh sâng tử ngoại vă chụp ảnh.
2.2.8. Điện di protein trín gel polyacrylamid
Độ tinh sạch cũng như khối lượng phđn tử của ch ế phẩm enzym được xâc định bằng phương phâp điện di trín gel polyacrylam id có chứa SDS (SDS-PAGE) của Laem m li (1970), sử dụng nồng độ gel cô lă 4% vă gel tâch lă 12%, nhộm bêns bằng dung dịch Coom assie Brilliant Blue(CBB).
2.2.9. Biểu hiện gen mê hóa Pfu ADN polymerase trong vi khuẩn BL21 mang
pLysS sử dụng vector pET28a
Q uâ trình biểu hiện gen pfu được thực hiện qua câc bước như sau:
- Cấy 1 khuẩn lạc chứa plasm id đê m ang gen pfu văo 55 ml môi trường LB chứa kanam ycin 50 ng/m l vă chloram phenicol 34 ng/m l, lắc ở 37°c, 200 vòng/phút qua đím.
- Chuyển dịch nuôi cấy văo 1 lít môi trường LB có chứa kanam ycin 50 |as/m l vă chloram phenicol 34 M-g/ml, nuôi lắc 37°c, 200 vòng/phút đến khi A 6no đạt 0,5. - Bổ sung IPTG văo dịch nuôi để đạt nồng độ cuối cùng lă 0,5 mM, nuôi cấy lắc
tiếp tục ở 3 7 °c sau 1, 2, 3, 5, 7 giờ.
- Lấy dịch nuôi cấy ra ly tđm 5.000 vòng/phút thời gian 10 phút ở 4 °c đí’ thu sinh khối tế băo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- H òa kết tủa tế băo trong đệm A có thănh phân như sau: 20 mM Tris-HCl pH 8,0; 500 m M NaCl; 5 mM imidazol; 0,1% Triton X-100, 1 m M PMSF.
- Siíu đm phâ tế băo bằng m ây M isom c X L2000, chuyển hỗn hợp văo bể ổn nhiệt 7 5 °c trong 15 phút. Sau đó ủ hỗn hợp lẻn đâ khoảng 10 phút.
- Ly tđm 14.000 vòng/phút trong 15 phút ờ 4 ° c đế thư dịch chiết tế băo, bao quăn dịch chiết ở -2 0 °c đến khi phđn tích.
2.2.10. Sắc kĩ qua cột âi lực Nickel-Agarose-NTA
Gel N i-A garose-N TA được ngđm trong nước cât 2 giờ vă được nhói văo cột (kích thước 1x6 cm ) đí có thí tích cột gel 2 cm. Cột 2el được cđn băns với đệm A. Dịch chiết tế băo chứa Pfu ADN pol được cho lín cột với tốc độ 10 m l/siờ. Câc protein không gắn với gel được rửa kỹ bằng đệm A cho đến khi A 2X1) của dịch qua
Nghiín cứu sản xuất enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03
cột < 0,01. Phần protein gắn trín cột được đẩy ra bằng 5 m l đệm A có 250 rnM im idazol.
2.2.11. Sắc kí qua cột Heparin-Sepharose-4B
G el Heparin-Sepharose-4B được lăm trương hoăn toăn trong nước cất, sau đó được nhồi văo cột (kích thước 1x6 cm ) để có thể tích gel 1 cm. Cột gel được cđn bằng với đệm A nhưng không chứa im idazol vă KC1 chỉ ở nồng độ 50 m M . Dung dịch enzym cũng được chuẩn bị trong cùng đệm dùng cđn bằng cột, được cho lẻn cột với tốc độ chảy 5 ml/giờ. Rửa cột bằng cùng loại đệm vă đẩy enzym gắn cột bans đệm A có chứa 500 m M KC1 (không có im idazol).
2.2.12. Kiểm tra hoạt độ tổng hợp ADN của Pfu ADN polymerase
H oạt tính của Pfu ADN polym erase thu được, ngoăi phương phâp PCR, còn được đânh giâ bằng phương phâp kĩo dăi oligo trong phức hợp khuốn-m ổi. Khuôn (T) lă m ột oligo gồm 60 nucleotid vă mồi (P) lă một oligo 32 nucleotid có trình tự bổ sung với đầu 5 ’ của T. Trong mỏi trường đệm thích hợp, khi có m ặt của Pfn
ADN polym erase vă dNTPs, mồi sẽ được kĩo dăi tạo ra A DN sợi kĩp. K ết quả được kiểm tra bằng điện di trín gel polyacrylam ide vă nhuộm bạc.
- Thănh phần của phản úng bao gồm:
isgmĩn cưu sân xuât enzym Ffu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QƠTĐ.03.03________________ _
h20 10,3 M.1
Đệm 10X 1,5 1^1
Oiigo 60 nt lăm khuôn (300 ng/ul) 1 nl Oligo 32 nt lăm mồi (150 ng/(il) l n l
dNTPs 25 mM 0,2 ụỉ
Dịch chứa Pfil ADN polymerase 1 til
Tổng thể tích 15 M-l
- Hỏn hợp phản úng được ủ ở 94°c trong 2 phút đí biín tính. 72°c tro ns 5 phút cho mồi gắn với khuôn vă ADN polym erase kĩo dăi mồi.
ỈVgnien cưu san xuât enzym r fu AD N polymerase bằng công nghệ ADN tâi tó’ hợp
Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGĨĐ.03.03______________
- Thănh phần gel polyacrylam id 15%:
H20 2,5 ml
Acrylamit 30% 2 ml
TBE5X 0,5 ml
APS 10% 20 ui
TEMED 7 ul
- M ẫu được tra văo giếng vă chạy ở 10 volt/cm gel khoảng 1 giờ 30 phút. Bân gel được lấy ra vă nhuộm bạc theo quy trình của Budowle et al. (1991). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Trong trường hợp cần kiểm tra ảnh hưởng của câc chất khâc nhau lín hoạt độ tổng hợp ADN của enzym , chất ảnh hưởng được ủ trước trong 5 phút với enzvm trong đệm phản ứng, sau đó cơ chất dNTPs được bổ sung để bắt đầu phản ứng, câc bước tiếp theo như được m ô tả ở trín.
CHƯƠNG 3 . K Ế T q u ả n g h i í n c ứ u
3.1. XĐY DỰNG PHƯƠNG PHÂP ĐÂNH GIÂ HOẠT ĐỘ ADN POLYMERASE BỂN NHIỆT
Đ ể đânh giâ hoạt động của ADN polym erase thông thường nsười ta sử dụnơ m ây nhấp nhây lỏng để đo lượng phóng xạ (thường lă 3H thym idin) được gắn văo trong phđn tử ADN bởi ADN pol. Tuy vậy, trong điều kiện của phòna thí nahiệm chúng tôi, việc đo hoạt độ phóng xạ như vậy lă không thể thực hiện được. Vì vậy, chúng tôi đê xđy dựng một phương phâp đânh giâ hoạt động ADN pol bans câch thiết k ế một oligo dăi 60 nucleotid lăm khuôn (T) vă m ột oligo dăi 32 nucleotid lăm mồi (P) có trình tự bổ sung với đầu 5 ’ của T. Do đó khi kết hợp với nhau sẽ có một phần 28 nucleotid trín sợi khuôn ở dạng sợi đơn. Khi có mặt của 4 loại dNTPs vă trong môi trường đệm thích hợp, nếu có A D N pol thì p sẽ được kĩo dăi bằng T vă có trình tự bổ sung với T. Sản phẩm sau đó được điện di trín gel polyacrylam id 15% vă nhuộm bạc để đânh giâ hoạt động của ADN pol.
Kích thước của câc đoạn T vă p được lựa chọn đù để phân biệt về độ di độn 2 trong điện di. Phương phâp nhuộm bạc được lựa chọn do có độ nhạy cao, hơn nữa nhuộm ethidium bromide mặc dầu rất nhanh vă cũng có độ nhạy cao nhưnu lại không có khả năng phât hiện câc đoạn A DN ngắn sợi đơn. Chúno tỏi sờ dĩ chon p dăi 32 để đảm bảo nhiệt độ gắn mồi trín 7 0 °c vă chỉ cho phản ứng tổng hơp thực hiện ở 7 0 °c trở lín, thích hợp cho việc lựa chọn ADN pol bền nhiệt, đồn í thời hạn chế tối đa sự tạp nhiễm ADN poỉ của tế băo vật chủ.
Hình 1 lă m inh hoạ về sự hoạt động của Pfu ADN pol với phươnơ phâp thiết lập. Băng điện di trín cột gel thứ nhất lă p, kích thước nhỏ nhất (oliso 32 nt. sợi đơn) chạy nhanh nhất, bêng trín cột gel thứ hai lă T (oligo 60 nt. sợi dơn) chay chậm hơn, băng trín cột gel thứ ba lă phức hợp T-P (32 nt kết hơp với 60 nt) chạy chậm hơn cả p vă T, băng trín cột gel thứ tư lă phức hợp T-P trong đó p đê được kĩo dăi bằng T (60 bp), có kích thước lớn nhất vă chạy chậm nhất. Sự xuất hiín cùa bêna có độ di động chậm nhất năy cũng chứng tò ADN pol hoạt độne. Khi khôns có ADN pol bển nhiệt, hoặc enzym bị ức chế thì băns có cùng độ di đ ộns như bêns ơ cột gel thứ ba. Chúng tôi đê sử dụng phương phâp kĩo dăi oligo năy, sons sons với phương phâp PCR để đânh giâ hoạt tính tổng hợp ADN cua Pfu ADN pol cũ n s như ảnh hưởng của một số chất khâc nhau lín hoạt tính của enzvm.
Nghiín cứu săn xuêt enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, DHQGHN, Ma so: QGTĐ.03.03
Pignien cưu san xuat enzym t'fu AD N polymerase bảng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ể tăi cấp trọng điểm, DHQGHN, Ma so: QGTĐ.03.03
1 2 3 4
©
Hình 1. Điện di sản phẩm phản ứng của Pfu ADN pol lín hệ thống khuôn (T) vă mồi (P)
C ộ t 1: Mồi (P). C ột 2: Khuôn (P)
Cột 3: Phức hợp T-P (không có Pfu ADN pol)