H oạt tính của Pfu ADN polym erase thu được, ngoăi phương phâp PCR, còn được đânh giâ bằng phương phâp kĩo dăi oligo trong phức hợp khuốn-m ổi. Khuôn (T) lă m ột oligo gồm 60 nucleotid vă mồi (P) lă một oligo 32 nucleotid có trình tự bổ sung với đầu 5 ’ của T. Trong mỏi trường đệm thích hợp, khi có m ặt của Pfn
ADN polym erase vă dNTPs, mồi sẽ được kĩo dăi tạo ra A DN sợi kĩp. K ết quả được kiểm tra bằng điện di trín gel polyacrylam ide vă nhuộm bạc.
- Thănh phần của phản úng bao gồm:
isgmĩn cưu sân xuât enzym Ffu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QƠTĐ.03.03________________ _
h20 10,3 M.1
Đệm 10X 1,5 1^1
Oiigo 60 nt lăm khuôn (300 ng/ul) 1 nl Oligo 32 nt lăm mồi (150 ng/(il) l n l
dNTPs 25 mM 0,2 ụỉ
Dịch chứa Pfil ADN polymerase 1 til
Tổng thể tích 15 M-l
- Hỏn hợp phản úng được ủ ở 94°c trong 2 phút đí biín tính. 72°c tro ns 5 phút cho mồi gắn với khuôn vă ADN polym erase kĩo dăi mồi.
ỈVgnien cưu san xuât enzym r fu AD N polymerase bằng công nghệ ADN tâi tó’ hợp
Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGĨĐ.03.03______________
- Thănh phần gel polyacrylam id 15%:
H20 2,5 ml
Acrylamit 30% 2 ml
TBE5X 0,5 ml
APS 10% 20 ui
TEMED 7 ul
- M ẫu được tra văo giếng vă chạy ở 10 volt/cm gel khoảng 1 giờ 30 phút. Bân gel được lấy ra vă nhuộm bạc theo quy trình của Budowle et al. (1991).
- Trong trường hợp cần kiểm tra ảnh hưởng của câc chất khâc nhau lín hoạt độ tổng hợp ADN của enzym , chất ảnh hưởng được ủ trước trong 5 phút với enzvm trong đệm phản ứng, sau đó cơ chất dNTPs được bổ sung để bắt đầu phản ứng, câc bước tiếp theo như được m ô tả ở trín.
CHƯƠNG 3 . K Ế T q u ả n g h i í n c ứ u
3.1. XĐY DỰNG PHƯƠNG PHÂP ĐÂNH GIÂ HOẠT ĐỘ ADN POLYMERASE BỂN NHIỆT
Đ ể đânh giâ hoạt động của ADN polym erase thông thường nsười ta sử dụnơ m ây nhấp nhây lỏng để đo lượng phóng xạ (thường lă 3H thym idin) được gắn văo trong phđn tử ADN bởi ADN pol. Tuy vậy, trong điều kiện của phòna thí nahiệm chúng tôi, việc đo hoạt độ phóng xạ như vậy lă không thể thực hiện được. Vì vậy, chúng tôi đê xđy dựng một phương phâp đânh giâ hoạt động ADN pol bans câch thiết k ế một oligo dăi 60 nucleotid lăm khuôn (T) vă m ột oligo dăi 32 nucleotid lăm mồi (P) có trình tự bổ sung với đầu 5 ’ của T. Do đó khi kết hợp với nhau sẽ có một phần 28 nucleotid trín sợi khuôn ở dạng sợi đơn. Khi có mặt của 4 loại dNTPs vă trong môi trường đệm thích hợp, nếu có A D N pol thì p sẽ được kĩo dăi bằng T vă có trình tự bổ sung với T. Sản phẩm sau đó được điện di trín gel polyacrylam id 15% vă nhuộm bạc để đânh giâ hoạt động của ADN pol.
Kích thước của câc đoạn T vă p được lựa chọn đù để phân biệt về độ di độn 2 trong điện di. Phương phâp nhuộm bạc được lựa chọn do có độ nhạy cao, hơn nữa nhuộm ethidium bromide mặc dầu rất nhanh vă cũng có độ nhạy cao nhưnu lại không có khả năng phât hiện câc đoạn A DN ngắn sợi đơn. Chúno tỏi sờ dĩ chon p dăi 32 để đảm bảo nhiệt độ gắn mồi trín 7 0 °c vă chỉ cho phản ứng tổng hơp thực hiện ở 7 0 °c trở lín, thích hợp cho việc lựa chọn ADN pol bền nhiệt, đồn í thời hạn chế tối đa sự tạp nhiễm ADN poỉ của tế băo vật chủ.
Hình 1 lă m inh hoạ về sự hoạt động của Pfu ADN pol với phươnơ phâp thiết lập. Băng điện di trín cột gel thứ nhất lă p, kích thước nhỏ nhất (oliso 32 nt. sợi đơn) chạy nhanh nhất, bêng trín cột gel thứ hai lă T (oligo 60 nt. sợi dơn) chay chậm hơn, băng trín cột gel thứ ba lă phức hợp T-P (32 nt kết hơp với 60 nt) chạy chậm hơn cả p vă T, băng trín cột gel thứ tư lă phức hợp T-P trong đó p đê được kĩo dăi bằng T (60 bp), có kích thước lớn nhất vă chạy chậm nhất. Sự xuất hiín cùa bêna có độ di động chậm nhất năy cũng chứng tò ADN pol hoạt độne. Khi khôns có ADN pol bển nhiệt, hoặc enzym bị ức chế thì băns có cùng độ di đ ộns như bêns ơ cột gel thứ ba. Chúng tôi đê sử dụng phương phâp kĩo dăi oligo năy, sons sons với phương phâp PCR để đânh giâ hoạt tính tổng hợp ADN cua Pfu ADN pol cũ n s như ảnh hưởng của một số chất khâc nhau lín hoạt tính của enzvm.
Nghiín cứu săn xuêt enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, DHQGHN, Ma so: QGTĐ.03.03
Pignien cưu san xuat enzym t'fu AD N polymerase bảng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ể tăi cấp trọng điểm, DHQGHN, Ma so: QGTĐ.03.03
1 2 3 4
©
Hình 1. Điện di sản phẩm phản ứng của Pfu ADN pol lín hệ thống khuôn (T) vă mồi (P)
C ộ t 1: Mồi (P). C ột 2: Khuôn (P)
Cột 3: Phức hợp T-P (không có Pfu ADN pol) Cột 4: T-P khi có P fu ADN pol
3.2. NHÊN DÒNG GEN MÊ HÓA PFU ADN POLYMERASE TỪ ADN HỆ GEN CỦA
PYROCOCCUS FURIOSUS
3.2.ỉ. Thiết kế primer vă nhên bản gen p fubăng PCR
Dựa trín trình tự nucleotid của Pfu ADN polvm erase được cỏnơ bố trín nađn hăng gen quốc tế (A ccession No: D I 2983) chúng tôi đê thiết k ế cặp mồi nhđn bân đoạn gen pfu lă PFU -F vă PFU-R có trình tự mô tả ờ dưới đđy. T rons đó mối xuôi (PFU-F) ngoăi phần trình tự trùng với phần đầu của sợi mê hóa trong aen pfu còn có điểm nhận biết của N d e\ vă mồi ngược (PFU -R) nơoăi phần trinh tự trim s với trình tự phần cuối sợi khuôn của gen pfu còn có điểm nhận biết của Sail. Hai vị trí Nile]
vă Sail đều có mặt trong vector pET28a lă vector chúng tõi dự kiến chọn lăm vector biểu hiện gen về sau.
PFU-F: 5' - AG AC AT AT G ATTTT AG AT GTGG ATT AC A -3 '
N d e ĩ
PFU-R: 5 ’-C C C G TC G A C G C T A G G A TTTTTTA A TG TT-3'
S a il
T ừ A DN genom e chúng tôi tiến hănh nhđn bản đoạn gen mê hóa Pfu ADN polym erase với 2 cập mồi trín theo thănh phần phản ứng vă chu trình nhiệt trình băv ở m ục 2.2.1. Sản phẩm phản ứng được điện di kiểm tra trín gel agarose 1%. K ết quả nhđn bản đoạn gen (được thể hiện ở hình 2) cho thấy trín cột 1 xuất hiện một băns sâng đậm , so với thang ADN chuẩn thì kích thước băng năy văo khoăns 2,4 kb. trùng với độ dăi của gen pfu theo tính toân lý thuyết. N hư vậy, chúng tôi cho rằn" đoạn gen m ê hóa cho Pfu ADN polym erase đê được nhđn bản.
jyghien cưu san xuât enzym t'fu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGĨĐ.03.03
k b M 1 k b
Hình 2. Điện di sản phẩm nhăn gen mê hóa cho Pfu ADN polvmerase
C ột M: Thang ADN chuẩn 1kb.
Cột 1: Gen mê hóa cho P fu ADN polym erase
3.2.2. Gắn sản phấm PCR (gen pfư) văo vector pCR2.1 vă biến nạp văo tế băo £ co//
Quổ trình nhđn dòng gen pfu được thực hiện bằng câch gân trực tiếp sân phẩm phản ứng PCR văo vector nhăn dòng pCR2.1, sau đó biến nạp văo tế băo vi khuẩn E. coỉi chủng T O PIO F’ vă tâch chiết ADN pỉasm id để chọn d ò ns tâi tổ hợp mang đoạn gen pfu.
V ector pCR2.1 (kích thước 3,9 kb) có hai gen k h ân s khâng sinh la am picillin vă kanam ycin, gen m ê hóa cho đoạn L a cZ a . Tế băo vi khuẩn E. coil
chủng TO PIO F’ có đặc điểm lă trong hệ gen của vi khuẩn năy có 2en Lưcl, do dó tạo ra protein ức ch ế prom oter của operon Lac. Vì vậy để operon Lac hoạt độ n2 cđn sự có mặt của chất câm ứng IPTG.
Mgnien cứu sân xuất enzym f f u ADN polymerase bảng công nghệ ADN tâi rổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03______________
Q uâ trình biến nạp vector tâi tổ hợp được thực hiện bằng phươns phâp sốc nhiệt. K ết quả biến nạp của chúng tôi cho thấy trín đĩa thạch cấy trải xuất hiện nhiều khuẩn lạc trắng (có khả nêng m ang câc vector tâi tổ hợp) vă một số khuẩn lạc xanh (chứa câc vector pCR2.1 nguyín bản tự đóng vòng). Câc khuẩn lạc phât triển được trín môi trường có khâng sinh kanam ycin lă do chúng có mang plasm id với gen khâng kanam ycin. N hững khuẩn lạc có m ău xanh xuất hiện lă do vector pCR 2.1 có mang operon Lac hoạt động bình thường, do đó tổng hợp nín (3- galactosidase, enzym năy thủy phđn cơ chất X -gal có mặt sẩn trong môi trường đí tạo nín sản phẩm có mău xanh. Trong khi đó, câc khuẩn lạc chứa câc plasm id tâi tổ hợp thì đoạn trình tự m ê hóa cho L a c Z a bị dịch khung đọc do bị chỉn văo của sản phẩm phản ứng PCR nín tế băo không tạo ra được p-galactosidase dạng hoạt độns, cơ chất X-gal không bị phăn giải vă khuẩn lạc có mău trắng. Tuy nhiín, trín thực tế không phải tất cả câc khuẩn lạc mău trắng đều mang gen mong muốn. Để xâc định được khuẩn lạc mang vector tâi tổ hợp mang gen pfu, chúng tôi đê tiến hănh kiểm tra băng PCR vă cắt câc plasm id đê tâch chiết bằng câc enzym giới hạn.
3.2.3. Kiểm tra sự có m ặt c ủ a gen p fu trong c â c khudn lạc
Chúng tôi chọn ngẫu nhiín ra 7 khuẩn lạc trắng đânh số từ 1 đến 7 vă 1 khuẩn lạc xanh. Với mỗi khuẩn lạc lấy ra một lượng nhỏ tế băo hòa trons 20 ưl H20, đun câch thủy 15 phút vă dùng lăm ADN khuôn để kiểm tra sơ bộ sự có mặt của sen
pfu băng PCR sử dụng chính cặp mồi PFU -F vă PFU -R (mục 2.2.1). Kết quă được thể hiện ở hình 3.
k b M 1 2 ỉ 4 6 « 7 ỉ k b
Hình 3. Điện di sân phẩm kiểm tra c â c khuân lạc băng PCR
C ột M: Thang ADN chuẩn 1kb. Cột 1: Khuẩn lạc xanh C ột 2 - 8: C âc khuẩn lạc số 1 - 7
Q ua hình 3 chúng tồi thấy rằng cả 7 khuẩn lạc từ 1-7 (cột 2-8) đểu xuất hiện m ột băng có kích thước tương đương với kích thước của gen pfu (khoảng 2,4 kb). tương tự như băng được nhđn lín bằng PCR từ A D N genom e của Pyrococcits fu rio su s, trong khi ở m ẫu khuẩn lạc xanh (cột 1) không xuất hiện băng năv. Kết quả
m ột bước nữa chứng tỏ câc khuẩn lạc trắng từ 1-7 m ang plasm id tâi tổ hợp vă được đânh dấu lă câc khuẩn lạc dương tính.
Chúng tôi lấy m ột phần tế băo từ khuẩn lạc xanh vă câc khuẩn lạc trắng dương tính ở trín nuôi cấy riíng rẽ trong môi trường LB lỏng chứa 50 u s/m l kanam ycin, ở 37°c, lấc với tốc độ 200 vòng/phút. Plasm id từ dịch nuôi cấy tế băo vi
khuẩn qua đím được tâch theo mục 2.2.4. Plasm id tâch từ mỗi khuẩn lạc được kiểm tra bằng điện di trín gel agarose 1%. Kết quả điện di kiểm tra (được thể hiện trín hinh 4) cho thấy tất cả câc plasm id tâch từ câc khuẩn lạc trắng (hình 4, cột 2-8) đều chạy chậm hơn câc plasm id tâch từ khuẩn lạc xanh (hình 4, cột 1). Như vậy, câc plasm id tâch từ câc khuẩn lạc trắng trín đều có khả nêng mang ADN nơoại lai nín có kích thước lớn hơn plasm id của khuẩn lạc xanh (vector pCR2.1 dạng vòng, khôns mang ADN ngoại lai). Để tiếp tục khẳng định đoạn gen gắn văo pCR2.1 lă pfu
chúng tôi đê xử lý câc plasm id tâi tổ hợp bằng câc enzym giới hạn E coR l, B ơ m tìh N d eỉ vă Sail.
1 2 3 4 5 6 7 8
ivgmen cưu san xuat enzym f f u AD N polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ liợp
Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03_______________ ____
Hình 4. Điện di sản phẩm tâch chiết plasmid từ câc khuẩn lạc
Cột 1: P lasm id tâch từ khuẩn lac xanh
Cột 2 - 8: P lasm id tâch từ khuẩn lac trắng 1 - 7
Nghien cưu san xuêt enzym Ffu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QGTĐ.03.03______________
Sau khi đê điện di kiểm tra câc plasm id tâch chiết từ câc khuẩn lạc trắna vă so sânh với plasm id tâch từ khuẩn lạc xanh, chúng tôi chọn ngẫu nhiín một đòns plasm id tâch từ khuẩn lạc trắng để cắt kiểm tra bằng B am H l, £ cớ R I vă cắt phối hựp
N d eI với Saỉl. Sản phẩm cắt được kiểm tra bằng chạy điện di trín gel asarose 1%.
K ết quả điện di được thể hiện ở hình 5.
N hư dự tính, chúng tôi thấy B ơ m tìỉ có m ột điểm nhận biết trín vector pCR2.1 vă m ột điểm nhận biết trín sản phẩm PCR nín sản phẩm cắt bằng Bam U l lă câc băng có kích thước tương ứng 0,65 kb vă 5,65 kb (hình 5, cột 3). Đối với enzvm
EcoRẢ có hai vị trí nhận biết trín vector pCR2.1 vă một vị trí nhộn biết trẽn săn phẩm PCR nín khi cắt bằng £ cơR I đê cho ba băng có kích thước 0,9 kb, 1,5 kb vă 3,9 kb (hình 5, cột 4). N d el vă Sail đều chỉ có một vị trí nhận biết trín cặp mồi PFU- F vă PFU -R nín khi cắt phối hợp hai enzym năy trong một phản ứng cho một băng có kích thước khoảng 3,9 kb (kích thước cùa pCR2.1) vă một băng có kích thước khoảng 2,4 kb (hình 5, cột 5), tương đương với sản phẩm PCR (hình 5, cột 6).
kb 1 2 3 M 4 5 6 kb
Hình 5. Điện di sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tâi tổ hựp băng câc enzym gioi han
C ột 1: AD N plasm id từ khuẩn lạc xanh. C ột 2: ADN plasmid từ khuẩn lac trẩng c ỏ t 3: ADN plasm id từ khuẩn lạc trắng đê xử lý với SamHI (0,65 kb + 5,65 kb) C ôt M: Thang A D N chuẩn 1kb
C õt 4: ADN plasm id từ khuẩn lac trắng đê xử lý với EcoR I (3,9 kb +1.5 kb + 0.9 kb) Cột 5: ADN plasm id từ khuẩn lac trắng đê xử lý với N de l vă SalI (3.9 kb + 2.4 kbj
C ột 6: Sản phẩm PCR
lygnien cưu san xuat enzym t'Ju AD N polymerase bằng công nghệ ADN tâi tổ hợp Đ ề tăi cấp trọng điểm, ĐHQGHN, M ê số: QƠTĐ.03.03______________
N hư vậy, có thể khẳng định chắc chắn rằng sản phẩm PCR đê gắn được văo vector nhđn dòng pC R 2.1 hay nói câch khâc việc nhăn dòng gen pfu đê được thực hiện thănh công. V ector tâi tổ hợp được ký hiệu lă pCR2.1pfu.
3.2.4. Xâc định trình tự gen mê hóa Pfu ADN polymerase
Việc xâc định trình tự nucleotid của gen pfu được tiến hănh trín mây xâc định trinh tự ABI PRISM ® 3100-Avant. Câc cặp mồi sử dụng xâc định trinh tự lă M 13F vă M 13R (được cung cấp theo kit của vector nhđn dòng) vă PFU-2F vă PFU- 2R (được thiết k ế sau khi xâc định được trình tự đoạn đầu vă đoạn cuối của gen). M ục đích của thí nghiệm năy lă để xâc định xem gen pfu nhđn dòng có mang lỗi hay không cũng như có khả năng m ê hóa cho protein có hoạt tính hay khôn2. Kết quả xâc định trình tự gen pfu được nhđn dòng sẽ được so sânh với trình tự của sen
pfu đê được công bố trong ngđn hăng gen quốc tế ( D I2983) vă được thể hiện ở hình 6. K ết quả so sânh cho thấy, ngoăi phần trình tự của điểm nhận biết của N d el ờ đầu (CATATG) vă Sail (GTCGAC) ở cuối thì trình tự gen pfit m ă chúng tôi nhăn dòng được lă tương đổng 100% với trình tự gen pfu trong ngân hăng gen. Điều năy cũns khảng định về sự tương đổng 100% về trinh tự axit amin của enzym do gen m ê hoâ vă lă cơ sở để cho phĩp biểu hiện gen thănh protein có hoạt tính.
P f u , D 1 2 9 8 3 ,
12 2 3 4
C A TA TG A TTTTA G A TG TG G Ằ TTA C A TA A C TG A A G A A G G A A A A C CTG TTA TTA G G CTA TTC A T A A T G A T T T T A G A T0TG G A TT A C A T A A C T 0Ă A G A A G G A A A A C C TG TT A T7A G 3 C T -.T T C p f u , D 1 2 9 8 3 , 7 2 2 9 4 A A A A AA GAGAACGGAAAATTTAAGATAGAGCATGATAGAACTTTTAGAOCATACATTTAC AAAAAAGAGA A CG G A A A A TTTA A G ATA G A GCA TG A TAG A A CTTTTA G .-.CCA TA CA 7T7A C
P f u , D 1 2 9 8 3 ,
1 3 2 3 5 4
GCTCTTCTCAGGGA TG A TTCA A A G A TTG AA G A A G TTA AG A A A A TA A CG G GG G AkA G G :a t
GCTCTTCTCA G G G A TG A TTCA A A G A TTG A Ă G A A G TTA A G A A A A TA Ă C G GjGC-AAAJGCAT
p f u , D 1 2 9 8 3 , 1 9 2 4 1 4 GG A A AG A TTGTGAGAATTGTTGATGTAGAGAAGGTTGAGAAAaAIjT T rC TC C -.j 2 AĂG . . . g g a a a g a t t g t g a g a a t t g t t g a t g t a g a g a a g g t t g a g a a a ă a g t t t c t c3 3 C A Ă G :■ ;? p f u , D 1 2 9 8 3 , 2 5 2 4 7 4 A TT A C C G TG T G G A A A C TT TA TT TG G A A C A T C C C C A A G A TG T TC C C A C TA TT A j ; \ jrS-S-S-J-. ATTACCGTGTGGAAACTTTATTTGGAACATCCCCAAGATGTTCCCACrATTAG«G«AAAA