Vi khuẩn được tuyển chọn sau khi lên men, tiến hành tách chiết enzyme từ vi khuẩn theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 2.1: Quy trình nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi khuẩn
Phần dịch nổi
Thử nghiệm hoạt tính Môi trường lỏng
Li tâm 3.000 vòng/20 phút/4oC
Phần dịch nổi L1 Phần sinh khối tế bào
Thử nghiệm hoạt tính
Phá vỡ màng tế bào bằng máy siêu âm
Phá vỡ màng tế bào bằng nitơ lỏng
Li tâm 10.000 vòng/20 phút
Huyền phù với 1ml đệm phosphate 0,02M
Sau 24 giờ lên men, tiến hành ly tâm 3000 vòng/20 phút/4oC. Thu hai phần là phần dịch nổi và phần sinh khối tế bào.
Phần dịch nổi được dùng để thử nghiệm hoạt tính enzyme fucoidanase ngoại bào.
Phần sinh khối tế bào: Rửa 2 lần với đệm phosphat 0,02M, pH 7.2 để loại các thành phần đường, protein bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Phá vỡ màng tế bào bằng máy siêu âm UZDN-2. Sau đó huyền phù với đệm phosphat 0,02 M, pH 7.2 tỉ lệ 1:3 (m sinh khối vi khuẩn : v đệm). Đặt dung dịch huyền phù ở 4oC trong 2 – 4 giờ để chiết enzyme. Tiến hành ly tâm 10.000 vòng/20 phút/4oC.
Thu phần dịch nổi và sử dụng để thử hoạt tính fucoidanase như là dịch enzyme nội bào.
2.2.4. Tủa enzyme bằng muối ammonium sulphate
1ml dịch chiết Ex được tủa bằng 0,516g ( NH4)2SO4 để ở 4oC qua đêm, li tâm và thu nhận phần tủa, hòa tan tủa trong 1ml đệm phosphate 0,02M rồi thẩm trong 3 giờ để tách loại muối.
2.2.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính enzyme
Một hỗn hợp dung dịch gồm 300µl dịch chiết tế bào vi sinh vật được trộn đều với 200µl cơ chất fucoidan , polymannuronic acid 2mg/ml, laminaran 1mg/ml (pha trong đệm phosphate 0.02M, pH 7.2) ủ 4 giờ ở 37oC.
Hoạt tính enzyme cắt mạch polysaccharide được đánh giá là sự tăng đường khử trong hỗn hợp phản ứng. Nồng độ của đường khử tạo thành được xác định theo phương pháp Nelson-Somogyi [29].
Dưới tác dụng của enzyme thuỷ phân polysaccharide, các loại polysaccharide bị cắt mạch tạo ra oligosaccharide và các đường khử. Vì vậy sự gia tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực enzyme. Nhờ tính chất khử của nhóm (-CHO) của đường khi phản ứng với dung dịch đồng hóa trị 2 tạo thành kết tủa Cu2O. Tủa Cu2O tan trong thuốc thử
arsenomolybden, tạo thành phức chất màu xanh da trời và phức này hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm. Như vậy có thể xác định khả năng phân giải polysaccharide thông qua hàm lượng Cu phản ứng.
Một đơn vị hoạt tính fucoidanase (U) được định nghĩa là số μM sản phẩm đường khử tạo thành trong 1 đơn vị thời gian (4 giờ ở 370C).
Đơn vị hoạt tính enzyme được tính theo công thức sau: U = X / 164 Trong đó, X: nồng độ fucose
U: đơn vị hoạt tính
1 μmol fucose = 164 μg/ml