Các sản phẩm hữu cơ từ rong biển ngày nay được sử dụng hết sức rộng rãi trong các ngành như: thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp dệt, nông nghiệp, công nghệ sinh học và nghiên cứu khoa học
Các polysaccharide từ rong biển được coi là những hợp chất hữu cơ không thể thay thế trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khi được sử dụng như là chất tạo đông, làm đặc, chất ổn nhũ và chất ổn định. Giá trị công nghiệp của rong biển là cung cấp các chất keo rong quan trọng như agar, alginat, carrageenan, furcellazan… dùng cho thực phẩm và nhiều ngành công nghiệp khác.
Các oligosaccharide có tác dụng kháng nấm bệnh, ức chế quá trình phát triển của tế bào ung thư, tế bào HIV...nhiều hợp chất hữu cơ trong rong biển có tác dụng điều hòa kích thích sinh trưởng đối với cây trồng nên đã được sản xuất thành phân bón hữu cơ [4].
Ngày nay, fucoidan được sử dụng như là thuốc chống ung thư hiệu quả. Ở Nhật Bản, người ta đã sản xuất viên nang fucoidan oligosaccharide. Viên nang fucoidan này có tác dụng như là chất ức chế di căn u mới sinh và chống nấm.
Trên thị trường Châu Âu đã xuất hiện MODIFILAN. Đây là sản phẩm của các nhà khoa học Nga sản xuất, do nhu cầu bức bách của việc khắc phục các hậu quả
của tai nạn nhà máy điện nguyên tử Chemobyl để làm thuốc có tác dụng chống ung thư.
Công ty cổ phần Fucoidan Việt Nam đã sản xuất ra Fucogastro, viên nang chứa 100 mg fucoidan 80%, chiết xuất từ rong Nâu Việt Nam có công dụng: Tăng cường sức khoẻ, nâng cao khả năng miễn dịch, ngăn ngừa sự hình thành khối u, hỗ trợ điều trị viêm loét và ung thư dạ dày, tá tràng.
Hình 1.4: Sản phẩm MODIFILAN và FUCGASTRO
Ngoài ra còn có một số sản phẩm như: Fucoidan của QINGDAO YIJIA
HUAYI IMPORT AND EXPORT CO.,LTD được sử dụng để phục hồi khả năng
kháng ung thư, sản phẩm thuốc kháng virus, điều trị ung thư, tim mạch; Fucoidan
Tongan Limu Moui của AHD INTERNATIONAL, LLC COMPANY trị tim mạch,
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên vật liệu
Bùn thải từ pilot sản xuất fucoidan chiết xuất từ rong S. mcclurei, Padina, S.
polycystum. Mẫu được thu từ cống thải của pilot sản xuất fucoidan, Viện Nghiên
cứu và Ứng dụng Công Nghệ Nha Trang.
Ngoài ra chúng tôi sử dụng fucoidan chiết từ loài rong S. mcclurei thuộc
ngành rong Nâu để nghiên cứu. Đây là loài rong phổ biến, có trữ lượng lớn và thành phần đường fucose khá cao (50,51%) nên đã được chọn làm nguồn carbon để phân lập vi sinh vật, đồng thời là cơ chất để thử hoạt tính enzyme. Bên cạnh đó chúng tôi
sử dụng fucoidan từ rong S. polycystum, S. microcystum và polymannuronic acid,
lamnianran chiết xuất từ rong polycystum để làm cơ chất cho các thử nghiệm hoạt tính enzyme nhằm so sánh các kết quả. Tất cả các cơ chất được sử dụng trong nghiên cứu này do Phòng Hoá phân tích và Triển khai công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công Nghệ Nha Trang cung cấp.
Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan [2]
Thành phần đường của Fucoidan SO3Na Acid uronic Rong
Fuc Xyl Man Glu Gal Rha w/w %
S. microcystum 28.9 6.94 11.27 9.83 30.35 12.72 26.69 21.20
S. polycystum 35.9 6.8 9.6 4.9 33.1 - 25.6 17.87
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật
- Cân 10g mẫu cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, lắc đều rồi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau.
- Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng.
- Hút 1ml ở bình tam giác sau khi lắc đều vào ống nghiệm, thu được dịch mẫu pha loãng với nồng độ 10-1, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều.
- Từ ống nghiệm 10-1, pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cách hút 1ml từ ống nghiệm 10-1 cho vào 9ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử trùng ở ống nghiệm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm có độ pha loãng mẫu 10-2, cứ làm như vậy cho đến khi được nồng độ thí nghiệm (để có số khuẩn lạc trên đĩa phù hợp, mẫu thường được pha loãng. Do hiếm khi biết trước được nồng độ vi sinh vật trong mẫu, người ta dùng nhiều nồng độ khác nhau). Tùy vào số lượng vi sinh vật nhiều hay ít mà ta cho nồng độ cấy thích hợp (thường từ 10-3 – 10-8).
- Môi trường phân lập vi sinh vật được chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào các đĩa petri, mỗi đĩa 10 – 15ml. Dùng pipet man hút 0,1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập. Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên bề mặt thạch. Sau 3 – 7 ngày ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC, vi khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch, ta tiến hành hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc.
- Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa petri cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để cho các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ẩm 30oC. Sau các khoảng thời gian thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng vi sinh vật, tiến hành tinh sạch nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra
độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi. Khi được khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống. - Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Tiến hành cấy ziczac trên ống thạch nghiêng để được giống thuần khiết. Giống thuần khiết được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC, thời gian tốt nhất là 1 tháng. Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyền định kì để đảm bảo dinh dưỡng cho vi sinh vật. Trước khi sử dụng chủng thuần khiết cần được hoạt hóa.
2.2.2. Phương pháp lên men vi sinh vật
Chủng vi sinh vật đã phân lập được tiến hành nuôi cấy lắc ở 150 vòng/phút, nhiệt độ 28-300C, trong 24 giờ, trong môi trường muối khoáng có bổ sung fucoidan sạch như là chất cảm ứng vi sinh vật sản xuất enzyme cắt mạch fucoidan.
2.2.3. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật
Vi khuẩn được tuyển chọn sau khi lên men, tiến hành tách chiết enzyme từ vi khuẩn theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 2.1: Quy trình nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi khuẩn
Phần dịch nổi
Thử nghiệm hoạt tính Môi trường lỏng
Li tâm 3.000 vòng/20 phút/4oC
Phần dịch nổi L1 Phần sinh khối tế bào
Thử nghiệm hoạt tính
Phá vỡ màng tế bào bằng máy siêu âm
Phá vỡ màng tế bào bằng nitơ lỏng
Li tâm 10.000 vòng/20 phút
Huyền phù với 1ml đệm phosphate 0,02M
Sau 24 giờ lên men, tiến hành ly tâm 3000 vòng/20 phút/4oC. Thu hai phần là phần dịch nổi và phần sinh khối tế bào.
Phần dịch nổi được dùng để thử nghiệm hoạt tính enzyme fucoidanase ngoại bào.
Phần sinh khối tế bào: Rửa 2 lần với đệm phosphat 0,02M, pH 7.2 để loại các thành phần đường, protein bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Phá vỡ màng tế bào bằng máy siêu âm UZDN-2. Sau đó huyền phù với đệm phosphat 0,02 M, pH 7.2 tỉ lệ 1:3 (m sinh khối vi khuẩn : v đệm). Đặt dung dịch huyền phù ở 4oC trong 2 – 4 giờ để chiết enzyme. Tiến hành ly tâm 10.000 vòng/20 phút/4oC.
Thu phần dịch nổi và sử dụng để thử hoạt tính fucoidanase như là dịch enzyme nội bào.
2.2.4. Tủa enzyme bằng muối ammonium sulphate
1ml dịch chiết Ex được tủa bằng 0,516g ( NH4)2SO4 để ở 4oC qua đêm, li tâm và thu nhận phần tủa, hòa tan tủa trong 1ml đệm phosphate 0,02M rồi thẩm trong 3 giờ để tách loại muối.
2.2.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính enzyme
Một hỗn hợp dung dịch gồm 300µl dịch chiết tế bào vi sinh vật được trộn đều với 200µl cơ chất fucoidan , polymannuronic acid 2mg/ml, laminaran 1mg/ml (pha trong đệm phosphate 0.02M, pH 7.2) ủ 4 giờ ở 37oC.
Hoạt tính enzyme cắt mạch polysaccharide được đánh giá là sự tăng đường khử trong hỗn hợp phản ứng. Nồng độ của đường khử tạo thành được xác định theo phương pháp Nelson-Somogyi [29].
Dưới tác dụng của enzyme thuỷ phân polysaccharide, các loại polysaccharide bị cắt mạch tạo ra oligosaccharide và các đường khử. Vì vậy sự gia tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực enzyme. Nhờ tính chất khử của nhóm (-CHO) của đường khi phản ứng với dung dịch đồng hóa trị 2 tạo thành kết tủa Cu2O. Tủa Cu2O tan trong thuốc thử
arsenomolybden, tạo thành phức chất màu xanh da trời và phức này hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm. Như vậy có thể xác định khả năng phân giải polysaccharide thông qua hàm lượng Cu phản ứng.
Một đơn vị hoạt tính fucoidanase (U) được định nghĩa là số μM sản phẩm đường khử tạo thành trong 1 đơn vị thời gian (4 giờ ở 370C).
Đơn vị hoạt tính enzyme được tính theo công thức sau: U = X / 164 Trong đó, X: nồng độ fucose
U: đơn vị hoạt tính
1 μmol fucose = 164 μg/ml
2.2.6. Định lượng protein theo phương pháp Lowry
Hỗn hợp phản ứng gồm 0,2ml mẫu + 0,3 ml đệm phosphate 0,02M + 2,5ml Lowry C, giữ trong tối 10 phút, thêm 0,25ml Follin E, đặt ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng OD = 750nm.
Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo thành phức chất màu xanh da trời. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thểxác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
2.2.7 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp
2.2.7.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Fucoidan
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ fucoidan thích hợp
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ fucoidan trong môi trường lên men với thành phần: 10g pepton; 0,1g KH2PO4; 0,1g MgSO4.7H2O; 500 ml nước cất; 500 ml nước biển; nồng độ fucoidan thay đổi từ 0 – 0,03% (w/v) lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi sinh vật lựa chọn và lên hoạt tính enzyme fucoidanase.
Tốc độ lắc 150 vòng/phút trong vòng 24 giờ ở 28 – 30oC. Tốc độ sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn được xác định theo phương pháp đo độ đục ở bước sóng 660 nm, hoạt tính enzyme fucoidanase được xác định theo phương pháp Nelson- Somogyi [29].
0,005%
0% 0,010% 0,015% 0,020% 0,030%
Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các nồng độ fucoidan
Xác định tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzyme
2.2.7.2 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ
Sơ đồ 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nguồn nitơ thích hợp
Nuôi cấy lắc chủng vi khuẩn lựa chọn trong môi trường lên men với nồng độ fucoidan tối ưu. Thành phần môi trường thay đổi nguồn nitơ: Bactopepton, pepton thịt, dịch chiết nấm men và đạm vô cơ.
Tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở 28 – 30oC. Tốc độ sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn được xác định theo phương pháp đo độ đục ở bước sóng 660 nm, hoạt tính enzyme fucoidanase được xác định theo phương pháp Nelson -
Somogyi [29].
Bactopepton Pepton thịt Dịch chiết
nấm men
Đạm vô cơ
Xác định tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzyme
Chọn nguồn nitơ nuôi cấy thích hợp Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các
2.2.7.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH
Sơ đồ 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy thích hợp
Nuôi cấy lắc chủng vi khuẩn trong môi trường lên men với thành phần môi trường tối ưu, pH thay đổi từ 6.0 đến 8.0 với tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở 28 – 30oC. Tốc độ sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn được xác định theo phương pháp đo độ đục ở bước sóng 660 nm, hoạt tính enzyme fucoidanase được xác định theo phương pháp Nelson-Somogyi [29].
6 6.5 7 7.5 8
Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các pH
Xác định tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzyme
2.2.7.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc
Sơ đồ 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tốc độ nuôi cấy lắc thích hợp
Nuôi cấy chủng vi khuẩn trong môi trường lên men với tốc độ nuôi cấy lắc thay đổi từ 80 – 240 vòng/phút trong 24 giờ ở 28 – 30oC. Tốc độ sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn được xác định theo phương pháp đo độ đục ở bước sóng 660 nm, hoạt tính enzyme fucoidanase được xác định theo phương pháp Nelson- Somogyi [29]. 100 vòng /phút 80 vòng /phút 120 vòng /phút 140 vòng /phút 160 vòng /phút 180 vòng /phút 200 vòng /phút 220 vòng /phút 240 vòng /phút
Xác định tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzyme
Chọn tốc độ nuôi cấy thích hợp Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các
2.2.7.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Sơ đồ 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thích hợp
Chủng vi sinh vật được lựa chọn được nuôi trong môi trường lên men với thành phần môi trường tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn. Tốc độ nuôi cấy 180 vòng/phút ở 28 – 30oC. Quá trình sinh trưởng của chủng vi sinh được xác định theo phương pháp đo độ đục. Mỗi giai đoạn sinh trưởng thu nhận sinh khối tế bào để tách chiết và thử nghiệm hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [29].
6 giờ 0 giờ 12 giờ 18 giờ 24 giờ 30 giờ 36 giờ 42 giờ 48 giờ
Xác định tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzyme
Chọn thời gian nuôi cấy thích hợp Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở
2.2.8. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme 2.2.8.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme 2.2.8.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme
Sơ đồ 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme
Enzyme sau khi tinh sạch được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên hoạt tính fucoidanase.
Một hỗn hợp gồm 50 µl enzyme với 200 µl fucoidan (2mg/ml) được pha trong đệm phosphate 0,02M pH từ 3 – 8. Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 24 giờ. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [29].
4
3.5 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi
Chọn pH cho enzyme hoạt động tối ưu
8
2.2.8.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme
Sơ đồ 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme
Một hỗn hợp gồm 50 µl enzyme với 200 µl fucoidan (2mg/ml) được pha trong đệm phosphate 0,02M pH tối ưu. Ủ hỗn hợp ở 25 – 50oC trong 24 giờ. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [29].
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi thí
nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
Số liệu được xử lý được vẽ trên phần mềm Ecxel với hệ số tương quan R≥ 0,95. 25oC 30 oC 35 oC 40 oC 45 oC
Khảo sát hoạt tính enzyme ở các nhiệt độ
Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson
Chọn nhiệt độ cho enzyme hoạt động tối ưu
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN