3.4.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme
Hình 3.4: pH tối ưu của fucoidanase chiết từ chủng SW21
Kết quả nghiên cứu cho thấy pH thích hợp cho hoạt động của fucoidanase từ chủng SW 21 trong khoảng 6.0-7.5 (Hình 3. 4). Trong đó enzym hoạt động tối ưu ở pH 6,5.
Kết quả này chúng tôi nhận khác với một số loài vi sinh vật khác như vi sinh
vật biển Vibrio sp. N-5 có pH hoạt động tối ưu là 7,5 [19], trong khi đó một số vi
pH tối ưu cho hoạt động của enzym Fucoidanase của chủng SW21 cũng khác với
Fucoidanase của động vật thân mềm Haliotis sp. là 5,4 [39] và Littorina kurila là
5,6 [23].
3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme
Hình 3.5: Nhiệt độ tối ưu để enzyme fucoidanase từ chủng SW21 hoạt động
Kết quả (Hình3.5) cho thấy fucoidanase hoạt động tốt nhất ở 35oC. Từ 50oC trở đi enzym bắt đầu bị biến tính nên hoạt tính giảm đi nhanh chóng.
Kết quả chúng tôi nhận được tương tự so với một số công trình của các nhà khoa học Nhật Bản khi nghiên cứu các enzym fucodanase từ một số loài sinh vật biển, trong khi một số vi sinh vật biển khác lại có enzym hoạt động ở nhiệt độ tối ưu là 30 - 35oC [37].
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym fucoidanase của chủng SW21 có
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Sau quá trình phân lập và sàng lọc khả năng sinh enzyme phân cắt
polysaccharide từ bùn thải trong quá trình sản xuất của nhà máy sản xuất fucoidan, chúng tôi đã thu được một số kết quả sau:
1. Chúng tôi đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn từ bùn thải trong quá trình sản xuất fucoidan của nhà máy sản xuất Fucoidan. Trong đó, 5 chủng (SW9, SW14, SW21, SW22, SW28) có khả năng năng sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan trên 3 loại cơ chất fucoidan được chiết từ 3 loài rong Nâu
S.mcclurei, S.polycystum, và Padina sp. với hoạt tính cao. Chủng SW21 là
chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cao nhất trên cả 3 loại fucoidan. Enzyme có hoạt tính bẻ ngắn mạch fucoidan đều là enzyme nội bào.
2. Điều kiện lên men tối ưu cho chủng SW21 là: - Hàm lượng fucoidan 0,01%
- Nguồn nitơ tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp fucoidanase là hỗn hợp Bacto pepton và dịch chiết nấm men với tỉ lệ 5:1,
- pH môi trường nuôi cấy là 7- 7.5
- Tốc độ nuôi cấy tối ưu là 160 vòng/phút - Thời gian nuôi cấy tối ưu là 24 giờ.
3. pH tối ưu cho hoạt động của fucoidanase từ chủng SW21 là 6,5
4. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của fucoidanase từ chủng SW21 là 35oC 4.2. Kiến nghị
1. Định danh chủng SW21
2. Tinh sạch enzyme cắt mạch fucoidan của chủng SW21 3. Nghiên cứu sâu hơn động học của enzyme
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Ngô Đăng Nghĩa, Luận án tiến sỹ, Tối ưu hóa quy trình công nghệ sản xuất alginate natri từ rong mơ Việt Nam và ứng dụng của nó trong một số lĩnh vực sản xuất, 1999
2. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sang (2007), Tạp chí Hóa học, tập 45, số 3, trang 339-342.
3. Phạm Đức Thịnh (2007), ‘Tách chiết và phân tích thành phần các
polysacchrid tan trong nước từ một số loài rong nâu Việt Nam’’, luận văn thạc sĩ, Viện Nghiên Cứu và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang, Khánh Hòa 4. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa
(2003), Chế biến rong biển, nhà xuất bản Nông nghiệp
TIẾNG ANH
5. Andrea, et al. (2009), Fucoidan and fucoidanase – focus on techniques for molecular structure elucidation and modification of marine polysaccharides. Appl Microbiol Biotechnol 82: 1-11.
6. B. Tangorone, J.C.Royer, J.P. Nakas, “Purification and characterization of an endo-(1,3)--D-glucanase from Trichoderma longibrachiatum”, Applied and environmental. Microbiology, (1989), Vol 55, No 1, pp 177 – 184).
7. Bakunina, I.Y., O.I. Nedashkov Shaia, S. A. Alekseeva, E. P. Ivanova, L.A. Romanenko, N. M. Gorshkova, V. V. Isakov, T.N. Zvyagintseva, and V.V. Mikhailov (2002), “Degradation of Fucoidan by the marine proteobacterium
Pseudoalteromonas citrea”, Microbiology, 71, 41-47.
8. Berteau O., McCort I., Goasdoue N. et al.,(2002), “Characterization of a new -L-fucosidase isolated from the marine mollusk Pecten maximus hat
catalyzes the hydrolysis of -L-fucose from Ascophylum nodosum”,
Glycobiology, 12, 273-282.
9. Berteau O., Mulloy B. (2003), “Sulfated fucans and an overview of enzimes
10. Bilan M. I., Grachev A. A. and Usov A. I. (2004), A highly regular fraction
of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus distinchus, Carbonhydr. Res.,
339, 511-517.
11. Bo Li, Fei Lu, Xịnin Wei and Ruixiang Zhao (2008), “Fucoidan: Structure
and Bioativity”, Molecules- 13, 1671-1695.
12.Daisuke Tachikawa, Masaji Nakamizo, Makoto Fujii, Anti-Turmo Activity
and Enhancement of NK Cell Activity by Fucoidan, 12th International Congress of Immunology and 4th Annual Conference of FOCIS, 2004
13. Daniel R., Berteau O., Jozefonvicz J., et al. (1999), “Degradation of algal
(Ascophyllum nodosum) Fucoidan by an enzymatic activity contained in digestive glands of the marine mollusk Pecten maximus”, Carbonhyd. Res.,
322, 291-297.
14. Dararad Choosawad, Ureporn Leggat, Chavaboon Dechsukhum, Amornrat Phongdara and Wilaiwan Chotigeat (2005), “Anti-turn our activities of
Fucoidan from aquatic plant Utricularia aurea lour”, SongklanakarinJ.Sei.
Technol., 27, 779-807.
15. Descamps V., Klarszinsky O., Barbeyron J. et al. (1998), “Fuco- oligosaccharides, enzym pour leur preparation a partir de fucanes, bacterie productricede l’enzym et application des fuco-oligosaccharides a la
protection des plantes”, Brevet, FR 2783523.
16. Dobashi, K.; Nishino, T.; Fujihara, M. (1989), “Isolation and preliminary characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides with blood-
anticoagulant activity from seaweed Hizikia fusiforme”, Carbohydr. Res.,
194, 315-320.
17.Fujimura, T.et (2000), “ Fucoidan is the component of focus vesiculosus that
promotes contraction of fubroblast – populated collgen gels’’, Biological
Pharmacology Bulleton, 23, pp 1180 – 1184
18. Furukawa S, Fujikawa T, Koga D, Ide A (1992), “Production of Fucoidan-
degrading enzyms, Fucoidanase and Fucoidan sulfatase by Vibrio sp. N-5”,
19. Furukawa, S.; Fujikawa, T.; Koga, D.; Ide, A. (1992), “Purification and some properties of exo-type Fucoidanases from Vibrio sp. N-5”, Biosci.
Biotechnol. Biochem.,56, 409-494.
20. Kitamura K, Matsuo M, Yasui T (1992), “Enzymic degradation of Fucoidan
by Fucoidanase from the hepatopancreas of Patinopecten yessoensis”, Biosci
Biotechnol Biochem, 56, 490–494
21. Kloareg, B., Dematry, M., and Mbeau, S (1986), “Polyanionic characteristic
of furified sulphated homofucans from brown algae”. Int.J.Bio Macromol-
8,pp 380-386.
22. Kobayashi T, Honke K, Miyazaki T, Matsumota K, Nakamura T, Ishizuka I, Makita A (1994), “Hepatocyte growth factor (HGF) specifically binds to
sulfoglycolipids”, J.Biol chem-269, pp9817-9821
23. Kusaykin, M.I.; Burtseva, Y.V.; Svetasheva, T.G.; Sova, V.V.;
Zvyagintseva, T.N. (2003), “Distribution of O-glycosylhydrolases in marine
invertebrates. Enzyms of the marine mollusk Littorina kurila that catalyze Fucoidan transformation”, Biochemistry (Moscow), 68, 317,324
24. Maria E.R. Duarte,a Marc A. Cardoso,a Miguel D. Noseda,a,1 Alberto S. Cerezo (2001), “Structural studies on Fucoidans from the brown seaweed
Sargassum stenophyllum”, Carbohydrate Research 333, pp 281–293
25. Maria I. Bilan, Alexey A. Grachev, Alexander S. Shashkov, Nikolay E, Nifantiev and Anatolii I. Usov (2006) “Structure of a Fucoidan from the
brown seaweed Fucus serratus L”, Carbohydrate Research 341, pp 238-245
26. Maruyama, Hiroko, Tâmuchi, Hidekazu; Hashimota, Minoru; Makano, Takahisa (2003), “Antitumor activity and immune response of Mekabu
Fucoidan extracted from sporophyll of Undaria pinnatifida”, In Vivo, 17(3),
245-249.
27. Morigana T, Araki T, Ito M, Kitamikado M (1981), “A search for Fucoidan-
degrading bacteria in coastal sea environments of Japan”, Bull Jpn Soc Sci
Fish, 47, 621–625
28. Mülheim an der Ruhr (2009), “Isolation, Characterisation, Modification an
29. Nelson TE (1944),“A photometric adaptation of the Somogy method for the
determination of glucose”, J. Biol. Chem. 153: 375–381.
30. Nomenclature of Cabonhydrates ( Recommendations 1996).
31. Painter, T.Alga Polysaccharides. In The polysacchrides, Aspinall, G.O.Ed Academic Press, Orlando, II, 196-285, 1983
32. Percival E.Algal polysaccharides.//In: The Carbohydrates. (Chemistry and Biochemistry). (W.Pigman, D.Horton eds.) – 1970.-N.Y.: Acad. Press.- V.IIB-.P.541-544)
33. Ponce, N.M.A.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B. (2003), “Fucoidans from the
brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies”. Carbohydr. Res., 338, 153-165.
34. R. Saravanan et al, “Isolation and Partial purification of extracellular enzyme (1,3)--D-glucanase from Trichoderma reesei (3239)”, Biotechnology 6(3)
(2007), pp 440 – 443).
35. Rita Elkins M.H (2001), “Limu Moui-prize sea plant of tonga and the south
pacific”, Woodland Publishing-Utah-USA 32 pagine
36. Sakai T, Ishizuka K, Kato I (2003b), “Isolation and characterization of a Fucoidan-degrading marine bacterium”, Mar Biotechnol 5, 409–416.
37. Sakai, T.; KaSWai, T.; Kato, I. (2004), Isolation and characterization of a Fucoidan-degrading marine bacterial strain and its Fucoidanase, Mar. Biotechnol, 6, 335-346.
38. Tanaka K., Sorai S. (1970), “Hydrolysis of Fucoidan by abalone liver α-L-
fucoisidase”, FEBS Lett., 9, 45-48
39. Thanassi, N.M.; Nakada, H.I. (1967), “Enzymic degradation of Fucoidan by
enzyms from the hepathopancreas of Abalone, Haliotus Species”, Arch.
Biochem. Biophys., 118, 172-177
40. Vedrenge M. Erlandsson – Harris H. Tarkowski A (2000), “Role of selectins
in experimental Staphylococcus aureus – induced arthritis’’ European
Journal of Immunology – 30, pp 1606 – 1613.
41. W.A.P.Black (1952), “Laboratory - Scale Isolation of Fucoidin from Brown
42. Wei D, Zhang L, Williams DL, Browder IW (2002) glucanstimulates human dermal fibroblast collagen biosynthesis through a nuclear factor-1 dependent mechanism. Wound repair regen. 10:161 – 168.
43. William DL (1997), Overview of ( 1 fi 3)- -D-Glucan immunobiology, Mediat, Inflamm, 6:247 – 250
44. Williams DL, Mueller A, Browder Ư (1996), Glucan-based macrophage stimulators: a review of their anti-infectivepotential, Clin, Immunother. 5: 392 – 399.
45. Yaphe W., and Morgan K. (1959), “Hydrolysis of fucoidin by Pseudomonas
atlantica and Pseudomonas carrageenova”, Nature, 463, 761-762
46. Zhongcun Pang, Kodo Otaka, Yasunori suzuki, Kyoji Goto, Masatake Ohnishi, “Purification and characterization of an endo-(1,3)--D-glucanase from Arthrobacter sp.”, Journal of Biology. Macromol, 4 (2) (2004), pp 57 – 66.)
47. Zhuang, Cun; Itoh, Hiroko, Mizono, Takashi Ito, Hitoshi (1995), “Antimor
active Fucoidan from the brown seaweed, Umitoranoo (Aargassum
thunbergii)”, Biosci Biotech Bi, , 9, 563-567.
48. Zvyagintseva T.N, Shevchenko N.M, Nazarenko E.L, et al.,(2005), Swater- soluble polysaccharides of some broSWn algae of he Russian Far-East. Structure and biological action of low-molecular mass polyuronans. Journal of Experiment Marine Biology and Ecology 320 123-131
49. http://www.hoalinhpharma.com.vn/Desktop.aspx/ND-Cam-nang-SK/Dinh- duong-an-toan-hop-ly/Thuc_pham_chong_viem_nhiem_trong_co_the/. 50. http://www.wattpad.com/858818-hoa-hoc
PHỤ LỤC Thiết bị chuyên dụng:
- Tủ cấy ( Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha) - Tủ sấy ( Binder, Đức)
- Máy lắc (GFL 3005,Đức)
- Nồi khử trùng autoclave ( Tommy Kogyo Co.Ltd, Nhật Bản)
- Máy định lượng protein bằng quang phổ hấp thụ phân tử ( UV/VIS) (Carry 100 Bio, Úc)
- Máy li tâm lạnh (Z36 HK, Germany) - Tủ lạnh
- Cân điện tử
Hóa chất, môi trường và thuốc thử
a. Thành phần môi trường phân lập
Nước cất 500 ml Nước biển 500 ml Glucose 1g Nấm men 1g MgSO4.7H2O 0,05g K2HPO4 0,2g Pepton 5g
b. Thành phần môi trường lên men Nước cất 500 ml Nước biển 500 ml MgSO4.7H2O 0,1g K2HPO4 0,1g Pepton 10g Fucoidan sạch 50 mg/1 lít pH 7,0 – 7,2
c. Dung dịch nước muối sinh lý
Hòa tan 8,5g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 20 phút rồi để nguội.
d. Đệm phosphat 0,02M pH 7,4
+ Pha K2HPO4 0,2M :Hòa tan 34,8g K2HPO4 trong 1 lít nước cất + Pha KH2PO4 0,2M : Hòa tan 27g KH2PO4 trong 1 lít nước cất
Dùng KH2PO4 0,2M để điều chỉnh pH của dung dịch K2HPO4 0,2 M về pH 7,2. Trước khi sử dụng pha đệm phosphate về nồng độ 0,02M
e. Cách pha hóa chất phương pháp Nelson
+ Thuốc thử Nelson A: Na2CO3 25g KNaC4H8O6.4H2O 23g NaHCO3 20g Na2SO4 20g Định mức đủ 1 lít
+ Thuốc thử Nelson B
CuSO4.5H2O 15g
H2SO4 đậm đặc 1 – 2 giọt
Định mức đủ 100 ml
+ Thuốc thử Nelson (A+B) với tỷ lệ A:B = 25:1 + Thuốc thử Nelson C: Dung dịch 1 gồm NH4Mo7O24.4H2O 33g H2O 50ml Dung dịch 2 gồm: Na2HASO4 9,4g H2O 50 ml
Trộn dung dịch 1 với 42 ml H2SO4 đậm đặc, sau đó thêm dung dịch 2, khuấy đều, đưa lên mức 1 lít bằng nước cất và đặt ở 37oC trong 1- 2 ngày trước khi sử dụng.
f. Cách pha hóa chất phương pháp Lowry
+ Lowry A: 20g Na2CO3 pha trong 1 lít NaOH(0.1M).
+ LowryB: 10g Na2C4H4O6 (hoặc K2C4H4O6) pha trong 30ml nước, thêm 5g CuSO4.5H2O. Định mức đủ 1 lít.
+ Lowry C: Hỗn hợp của hai dung dịch lowry A và lowry B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi dùng).
Cách dựng đường chuẩn fucose
- Pha dung dịch fucose chuẩn 100µg/mL.Từ dung dịch này pha thành các dung dịch có nồng độ khác nhau: Nồng độ fucose (µg/ml) Thể tích dung dịch chuẩn (ml) Thể tích nước cất (ml) OD trung bình 100 0.5 0 2.615 80 0.4 0.1 2.314 60 0.3 0.2 1.502 40 0.2 0.3 1.073 20 0.1 0.4 0.215 0 0 0.5 0
- Cho 0,5ml mỗi dung dịch vào ống nghiệm, thêm vào các ống nghiệm 0,5ml thuốc thử Nelson (A+B).
- Đun cách thủy ở 100oC trong khoảng 20 phút. - Để nguội, cho 0,5 ml thuốc thử Nelson C, lắc đều. - Thêm 7ml nước cất vào mỗi ống.
- Đo mật độ quang ở 750nm - Dựng đường chuẩn
Cách dựng đường chuẩn Lowry
Dùng albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn.Cân 3.2mg albumin huyết thanh bò chuẩn pha trong 3.2ml nước (nồng độ 1mg/ml). Pha chất chuẩn với các nồng độ khác nhau. Nồng độ protein µg/ml Thể tích chất chuẩn (µl) Thể tích nước cất (µl) OD 750 10 10 990 0 30 30 970 0.03 50 50 950 0.05 70 70 930 0.1 100 100 900 0.123 200 200 800 0.178
- Lấy lấy chính xác 0,5ml dung dịch albumin huyết thanh bò ở nồng độ pha loãng như trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch lowry C.
- Để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml thuốc thử folin E - Đo mật độ quang ở 750nm
- Dựng đường chuẩn
Hình P1: Hình ảnh cấy ria chủng SW9 trên môi trường phân lập
Hình P3: Hình ảnh cấy ria chủng SW22 trên môi trường phân lập